Подходы к экспериментальному моделированию нейровоспаления при нейродегенеративных заболеваниях: часть 2 — генетические модели

Введение

Преимуществом генетических моделей в сравнении с классическими животными моделями заболеваний является высокая специфичность, позволяющая воздействовать на один ген или биохимический путь, что является перспективной платформой для тестирования таргетных биопрепаратов (антител к цитокинам, малых молекул), однако нужно учитывать и ряд ограничений:

— видоспецифичность иммунной системы человека и мыши, микроглия существенно различается по профилю экспрессии генов и ответу на стимулы;
— упрощение патологии: нейродегенеративные болезни у человека — многофакторные, и одна мутация не может воспроизводить всего спектра патологического состояния;
— проблема «суперпатологии»: чрезмерная экспрессия гена может приводить к артефактам, не релевантным для человека;
— во многих моделях сложно определить, является ли воспаление триггером или следствием нейродегенерации;
— отсутствие старения как ключевого фактора риска: большинство исследований проводят на молодых животных, тогда как у человека нейровоспаление (НВ) прогрессирует с возрастом.

В этой статье (часть 2) мы обсудим основные генетические модели НВ и опишем их особенности.

Трансгенные модели, воспроизводящие ключевые патологии

Модели, направленные на экспрессию мутантных форм генов предшественника амилоида (APP) и пресенилинов (PS). Воспроизводят амилоидоз, активацию микроглии (фенотип «болезни-ассоциированной микроглии» — DAM) и астроглиоз.

Мыши PDAPP — одна из первых трансгенных моделей болезни Альцгеймера (БА), характеризуется гиперэкспрессией человеческого амилоидного предшественника APP (amyloid precursor protein) с мутацией V717F под контролем промотора PDGF-β. В результате наблюдается 18-кратное увеличение уровня РНК гена APP и 10-кратное увеличение концентрации белка APP, что в свою очередь приводит к накоплению Aβ. Особенностью данной модели является многократное увеличение концентрации Aβ42 — формы β-амилоида, более склонной к агрегации в области коры и гиппокампа, с последующей активацией астроцитов и микроглии, что, в свою очередь, вызывает НВ и нейродегенерацию [1].

APP/PS1 мыши экспрессируют химерный человеческий/мышиный APP с мутациями семейной формы БА. Эти мутации способствуют быстрому и устойчивому накоплению Aβ, что приводит к продолжительной нейровоспалительной реакции и синаптической дисфункции в областях отложения сенильных бляшек и амилоидных агломератов [2].

5xFAD — линия трансгенных мышей, полученная путём введения двух генов человека с пятью мутациями. Модельные животные сверхэкспрессируют мутантный APP человека (A4) 695 со шведской (K670N, M671L), флоридской (1716V) и лондонской (V717I) мутациями семейной болезни Альцгеймера, и PS1 человека, содержащий две мутации FAD — M146L и L286V. Экспрессия обоих трансгенов регулируется нейронспецифическими элементами мышиного промотора thy1 [3]. У мышей 5xFAD наблюдается повышенная экспрессия APP, коррелирующая с ускоренным отложением амилоидных фрагментов Aβ1-40 и Aβ1-42 в головном мозге и спинномозговой жидкости, которая быстро увеличивается с возрастом. Гистологический анализ коры головного мозга и гиппокампа выявил значительное количество бляшек и образование нейрофибриллярных клубков, сопровождающееся сильным НВ. Эти патологические признаки также значительно усиливаются с возрастом. Примерно на третьем месяце жизни одновременно с образованием бляшек начинает развиваться астроглиоз и микроглиоз. У 5xFAD мышей снижены уровни белка синаптического маркера, повышены уровни p25, наблюдаются нейродегенеративные и когнитивные нарушения [4].

APP23. Животные этой модели экспрессируют человеческий APP 751 со шведской двойной мутацией (K670N/M671L) под влиянием нейронспецифического мышиного промотора thy1, в результате экспрессия человеческого APP увеличивается в семь раз по сравнению с эндогенным содержанием APP у мышей дикого типа. Мыши APP23 характеризуются образованием в гиппокампе и неокортексе более устойчивых амилоидных бляшек, продукция которых экспоненциально растёт по мере старения. Данные отложения сопровождаются НВ, синаптической дисфункцией, утратой нейронов и гиперфосфорилированием тау-белка [5].

Tg2576 — ещё одна модель, гиперэкспрессирующая человеческий APP с двойной шведской мутацией, регулируемая промотором гена прионного белка хомяка. Эта мутация увеличивает продукцию β-амилоида обеих форм — Aβ42 и Aβ40. Tg2576 мыши демонстрируют относительно медленный темп образования амилоидных бляшек, сопровождающийся дефицитом антиоксидантов в неокортексе — глутатионпероксидазы 1 (GPV1), супероксидисмутазы-1 и -2, а также наблюдаются глиоз, астроцитоз, нарушение обмена глюкозы и нейродегенеративные нарушения [6].

3xTg-AD представляет собой одну из наиболее биологически значимых моделей животных, описанных на сегодняшний день, поскольку она воспроизводит все гистопатологические и поведенческие признаки БА. Мыши 3xTg-AD содержат три генетических локуса, связанных с БА: человеческий PS1 M146V, человеческий APP SWE K670N/M671L и человеческий тау-белок P301L. У этих мышей наблюдаются патологии как в виде бляшек, так и в виде клубков. Отложение Aβ [7].

Модели с экспрессией мутантных форм тау-белка (МАРТ-трансгенные мыши) и белка клеточного некроптоза MLKL (Mixed-lineage kinase domain-like)

P301S — это генетическая модель мышей с мутацией P301S в гене тау-белка (MAPT), экспрессирующая 383 изоформу человеческого тау-белка под влиянием мышиного промотора thy1. Для нее характерно накопление агрегатов тау-белка, нейрофибриллярных клубков, атрофия мозга, когнитивные нарушения и дисфункция двигательной системы. Уже на третьем месяце жизни у мышей наблюдается потеря синапсов в гиппокампе вследствие патологической активации микроглии и НВ [8, 9].

rTg4510 мыши экспрессируют человеческий тау-белок, содержащий мутацию P301L, которая была связана с лобно-височной деменцией, и они имитируют признаки человеческой тауопатии, включая гиперфосфорилирование тау-белка, потерю нейронов и ухудшение памяти. Эта модель демонстрирует устойчивую агрегацию тау-белка и нейродегенерацию, однако несколько факторов, помимо сверхэкспрессии hTau, усложняют интерпретацию результатов. Следует учитывать возможность побочных эффектов, возникающих в результате введения трансгена в локус Fgf14. Нарушение работы этого гена, критичного для возбудимости нейронов, может независимо способствовать некоторым наблюдаемым поведенческим нарушениям, особенно тем, которые связаны с координацией движений и исследовательским поведением [10].

PS19 — трансгенные мыши PS19 сверхэкспрессируют человеческую изоформу тау-белка, T34 и 4 домен связывания с микротрубочками (1N4R) тау-белка с мутацией P301S под регуляторным контролем мышиного прионного промотора. Мыши PS19 являются популярной моделью для изучения патологии, агрегатов тау-белка, а также других симптомов, связанных с БА, таких как возрастные когнитивные нарушения. Нейродегенеративное заболевание у мышей PS19 обусловлено p16INK4a-экспрессирующими эндотелиальными клетками и микроглией [11].

Tg-Mlkl−/− образованы путём скрещивания мышей с нокаутом по белку клеточного некроптоза MLKL и трансгенных мышей с мутацией SNCA A53T. Эта новая модель точно имитирует прогрессирующие признаки болезни Паркинсона. Эксперименты in vitro показали, что ингибирование MLKL снижает гибель клеток, вызванную 6-гидроксидофамином и TNF-α или токсичными предварительно сформированными фибриллами α-Syn (PFF). Более того, снижение уровня MLKL приводило к улучшению двигательных симптомов, уменьшению НВ и снижению экспрессии фосфорилированного α-Syn в областях чёрной субстанции (SN), коры головного мозга и полосатого тела трансгенных мышей A53T [12].

Модели, нацеленные на иммунные клетки ЦНС

CX3CR1-GFP/+ (и аналоги) — генетическая модель, которая используется для изучения роли рецептора хемокина CX3CR1 в НВ. Модель используется как инструмент для визуализации активности моноцитов в мозге и иллюстрирует потенциал многофункционального флуоресцентного метода на основе Cx3cr1 (gfp/+) для анализа функции моноцитов in vivo [13].

hM3Dq/hM4Di (DREADD) в клетках микроглии позволяет хемогенетически активировать или подавлять специфические популяции иммунных клеток и изучать последствия для нейронов и поведения. DREADD-технология основана на создании молекул, активирующих клеточную сигнализацию мускариновых рецепторов. Модифицированная форма мускаринового рецептора человека M3 — hM3Dq (DREADD, связанный с Gq) используется для усиления нейрональной активности, в то время как hM4Di (DREADD, связанный с Gi/o) используется для подавления нейрональной активности [14].

TREM2-ko — генетическая модель НВ, в которой нокаутирован ген TREM2. TREM2 — трансмембранный белок, который экспрессируется исключительно в микроглии головного мозга. Редкие варианты мутаций R47H, R62H и H157Y в гене TREM2 повышают риск позднего начала БА. Модель мышей с нокаутом TREM2 R47H используется для изучения демиелинизации. Модель TREM2 H157Y — для изучения развития амилоидоза [15].

Модели системного воспаления, влияющего на мозг

Трансгенные животные с провоспалительным фенотипом (IL-1β, p25, NGF)

IL-1βXAT — трансгенные мыши, гиперэкспрессирующие человеческий IL-1β. Характерным проявлением НВ является повышенная продукция IL-1β, что приводит к развитию микроглиоза и астроглиоза с хроническим повышением уровня провоспалительных цитокинов. Отличительной особенностью этой модели является отсутствие нейродегенеративных изменений в мозге, не изменяется синтез предшественника β-амилоида, несмотря на наличие когнитивных нарушений. Данная модель может служить для воспроизведения НВ без нейродегенеративных изменений [16].

Трансгенная модель с гиперпродукцией субъединицы p25 циклинзависимой киназы 5 (CDK5). В норме в клетках головного мозга экспрессируется субъединица p35, которая, образуя комплекс с CDK5, участвует в кортикогенезе, регуляции метаболизма синаптических везикул, высвобождении нейротрансмиттеров и передаче сигналов. При патологии активируется расщепление субъединицы p35 до p25 за счёт воздействия кальций-зависимой киназы, что приводит к дисрегуляции CDK5 и развитию нейротоксических эффектов. У мышей с гиперпродукцией p25 развивается НВ, гиперфосфорилирование тау-белка, когнитивный дефицит и накопление амилоида. В исследованиях на модели показано, что генетический нокдаун CDK5 может предотвращать образование нерастворимого тау-белка в гиппокампе и ухудшение пространственной памяти у мышей с гиперпродукцией p25 [17].

Модели с дефицитом NGF (нокауты NGFR100W) — в основе данной модели лежит создание трансгенных животных с мутацией в гене фактора роста нервов (NGF). У таких животных наблюдается развитие нейродегенеративных процессов, которые характеризуются дефицитом зрительного распознавания и пространственной памяти, дегенерацией нейронов, холинергическим дефицитом, гиперфосфорилированием тау-белка и появлением бляшек β-амилоида. На биохимическом уровне также наблюдается экспрессия ряда провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, TNF-α и IFN-γ-индуцированная АТФаза, за счёт развития аутоиммунной реакции [18].

Заключение

Современные генетические модели — это мощный, но ещё несовершенный инструмент для исследования нейробиологии и фармакологической коррекции НВ. Экспертный анализ требует чёткого понимания, какой конкретный аспект НВ и на какой стадии изучается, учёта видовых ограничений и артефактов модели. Поэтому для отражения более полной картины многофакторного процесса нейровоспаления необходимо сочетание генетических подходов с другими методами. Перспективным направлением в моделировании НВ является комбинация генетических и химических триггеров, например, индукция нейропатологии системным воздействием токсинов на организм животных, подвергшихся генетической коррекции.