Preview

Фармакокинетика и Фармакодинамика

Расширенный поиск

Изучение фармакокинетики [3Н]-циклопролилглицина в крови крыс

https://doi.org/ 10.24411/2587-7836-2018-10024.

Полный текст:

Аннотация

Изучена фармакокинетика меченого по тритию метаболита ноопепта циклопролилглицина [3Н]-ЦПГ после внутривенного болюсного введения в дозе 5,7 мкг (2 мКи). Мечение субстанции ЦПГ проводили с помощью реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена. Обнаружено, что временной характер изменений концентрации [3Н]-ЦПГ в крови крыс подчиняется двухкамерной модели. Расчёт фармакокинетических параметров показал, что α-фаза (фаза распределения) протекает очень быстро, а β-фаза элиминации [3Н]-ЦПГ достаточно продолжительна. При этом величина Т1/2α составляет 1 мин, а Т1/2β - 80 мин. Эти данные согласуются с ранее полученными результатами по фармакокинетике ЦПГ как метаболита, образующегося из лекарственного препарата ноопепт. ЦПГ существенно отличается от других дипептидных соединений по величинам фармакокинетических параметров (Т1/2e , MRT и др.), что предполагает наличие у него большей продолжительности фармакологического действия.

Для цитирования:


Ковалёв Г.И., Золотарёв Ю.А., Дадаян А.К., Шрам С.И., Абдуллина А.А., Васильева Е.В., Колыванов Г.Б., Жердев В.П. Изучение фармакокинетики [3Н]-циклопролилглицина в крови крыс. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2018;(3):48-56. https://doi.org/ 10.24411/2587-7836-2018-10024.

For citation:


Kovalev G.I., Zolotarev Yu.A., Dadayan A.K., Shram S.I., Abdullina A.A., Vasileva E.V., Kolyvanov G.B., Zherdev V.P. The Study of [3H]-Cycloprolylglycine Pharmacokinetics in Rat Blood. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2018;(3):48-56. (In Russ.) https://doi.org/ 10.24411/2587-7836-2018-10024.

Введение

Циклопролилглицин (ЦПГ, цикло-(Про-Гли)) был сначала описан в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова в качестве одного из основных метаболитов препарата ноопепт [1].

Впоследствии ЦПГ был обнаружен в мозге крыс с помощью ВЭЖХ и ГЖХ, а также масс-спектрометрического анализа с ионизацией электронным ударом в качестве эндогенного соединения, средняя концентрация которого составила 2,8 ± 0,3 нмоль/г сырой ткани [2]. Фармакологическое изучение позволило выявить у него антиамнестическую [3], анксиолитическую [4], антигипоксическую, нейропротекторную [5] активности, которые он проявляет в диапазоне доз от 0,05 до 1 мг/кг. Помимо этого, ЦПГ увеличивал содержание нейротрофина BDNF в культурах гиппокампальных мышиных клеток линии HT-22 и клеток нейробластомы человека линии SH-SY5Y как в норме, так и при моделировании повреждения с помощью глутамата и 6-гидроксидофамина [6].

Целью настоящего исследования стало изучение фармакокинетики пептида циклопролилглицин с использованием его радиоактивномеченного тритием производного [G-3Н]-ЦПГ.

Материалы и методы

Получение радиоактивномеченного тритием пептида ЦПГ. Реакцию ВТКИО с газообразным тритием проводили при температуре 170 °С в твёрдой смеси, образованной ЦПГ, нанесённым на неорганический носитель, и высокодисперсным катализатором платиновой группы. ЦПГ в количестве 1,0 мг растворяли в 1 мл воды и смешивали с 20 мг неорганического носителя. Воду удаляли при уменьшенном давлении при 20 °С. Неорганический носитель с нанесённым препаратом смешивали с 10 мг гетерогенного катализатора платиновой группы. В ампулу объёмом 10 мл помещали полученную твёрдую смесь, вакуумировали, заполняли газообразным тритием до давления 250 торр и проводили реакцию ВТКИО при повышенной температуре. Ампулу охлаждали, вакуумировали, продували водородом. Пептид десорбировали 20 % водным этанолом. Для удаления лабильного трития меченый пептид ещё дважды растворяли в 20 % водном этаноле и упаривали досуха. Хроматографическую очистку проводили с помощью ВЭЖХ на колонке Кромасил в градиенте метанола в присутствии 0,1 % трифторуксусной кислоты (рис. 1). Пептид упаривали и растворяли в этаноле до радиоактивной концентрации 1 мКи/мл. Реакцией ВТКИО с тритием были получен меченый тритием пептид [3H]-ЦПГ с молярной радиоактивностью 54 Ки/ммоль в количестве 20 мКи и радиохимической чистотой более 98 %, с использованием уникальной установки по обмену водорода на тритий ОВТ-1 (Отдел химии физиологически активных веществ ИМГ РАН).

Животные и их содержание. В исследованиях использовали здоровых половозрелых крыс-самцов линии Вистар (n = 3), весом 340 ± 10 г. Содержание животных соответствовало действующим санитарным правилам по содержанию лабораторных животных. Исследование выполнялось согласно Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств [7] и Правилам лабораторной практики в Российской Федерации [8]. Все процедуры в исследовании выполнялись согласно утверждённым Комиссией по гуманному обращению с животными протоколам.

Введение животным пептида ЦПГ и отбор крови. Введение пептида ЦПГ и отбор крови осуществляли через ярёмные вены. Перед введени ем пептида крыс анестезировали смесью кетамина (91 мг/кг) и ксилазина (9,1 мг/кг), после чего с вентральной стороны справа и слева препарировали две ярёмные вены и устанавливали внутривенные катетеры, слева – FlexicathG24 (Apexmed, Нидерланды), а в правую – FlexicathG22 (Apexmed, Нидерланды). В левую ярёмную вену вводили 80 мкл гепарина и затем в течение 10-15 с – раствор радиоактивно меченого пептида ЦПГ (2000 мкКи, 5,7 мг/кг) в объеме 200 мкл. По истечении определенного времени (1; 2,5; 4; 6; 10; 20; 40; 60 и 90 мин) из правой ярёмной вены отбирали примерно по 0,4 мл венозной крови, которую помещали в пластиковые пробирки и быстро замораживали в жидком азоте.

Анализ содержания пептида [3H]-ЦПГ в образцах крови. При приготовлении препаратов для ВЭЖХ анализа замороженные и взвешенные образцы крови в пластиковых пробирках подвергались лиофильной сушке в течение 2 суток. После чего, высушенные образцы прогревались для удаления пептидазной активности тканей. Для приготовления пептидного экстракта проводили последовательные экстракции органическими растворителями, упаривание под уменьшенным давлением и центрифугирование. Лиофильно высушенные образцы крови прогревали при 65 °С в течение 30 минут, после чего образцы измельчались в этих же пластиковых пробирках горизонтальными ножами, вращающимися со скоростью 5000 об./мин. Первую экстракцию этих образцов проводили 90 % водным ацетонитрилом, содержащим 1 % трифторуксусной кислоты. После центрифугирования раствор, содержащий меченый тритием пептид и компоненты плазмы крови, подвергался сушке под уменьшенным давлением, реэкстракции метанолом и повторному центрифугированию. Полученный при этом раствор, содержащий меченый тритием пептид и компоненты плазмы крови, подвергался сушке под уменьшенным давлением, реэкстракции 0,1 % водным раствором гептафтормасляной кислоты и последующему центрифугированию.

Радиохроматографический анализ проводили с помощью ВЭЖХ на колонке Кромасил С18,5 мкм, 150 х 4 мм в присутствии 0,1 % трифторуксусной кислоты. Выбраны условия анализа с помощью ВЭЖХ, позволяющие выделить фракцию, соответствующую ЦПГ, и отделить дипептиды PG и GР, являющиеся возможными пептидными метаболитами протеолитического гидролиза (рис. 2).

Хроматографические фракции, соответствующие пептиду ЦПГ, собирали и анализировали с помощью жидкостного сцинтилляционного счётчика TriCarb 2900TR (“PerkinElmer”) с эффективностью счёта 45 %. Количественные значения радиоактивномеченого ЦПГ в пробе нормировали по внутреннему стандарту.

Анализ фармакокинетических данных. Анализ фармакокинетических параметров ЦПГ проводили в рамках модельного подхода согласно Рекомендациям по проведению доклинических исследований [7]. Для расчётов параметров и построения графиков использовали программу Sigma Plot 11.0. Фармакокинетические кривые («концентрация ЦПГ-время») для расчёта фармакокинетических параметров были построены по усреднённым значениям концентраций ЦПГ в крови, полученным из данных для 3 животных.

Результаты и обсуждение

Соединения пептидной природы находят все большее применение при разработке новых лекарственных препаратов [9, 10]. Важными их преимуществами являются высокая эффективность и чрезвычайно низкая токсичность. Однако исследование их фармакокинетических свойств сопряжено с целым рядом проблем. Прежде всего это обусловлено их быстрой деградацией в тканях и образованием множества метаболитов. Уникальные возможности для получения корректных результатов при анализе фармакокинетики пептидов даёт использование равномерно меченных изотопами водорода пептидов, содержащих изотопную метку во всех аминокислотных остатках [11]. Для получения таких пептидов ранее было предложено использовать реакцию высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) [12, 13]. В Отделе химии физиологически активных соединений Института молекулярной генетики РАН в течение ряда лет проводятся исследования по изучению твёрдофазных каталитических реакций с изотопами водорода, получившие признание в нашей стране и за рубежом. Важной особенностью реакции ВТКИО является то, что изотопный обмен в пептидах и белках происходит с сохранением их биологических свойств [14]. Метод позволяет получать изотопномеченные белки и пептиды, в которых атомы изотопов распределены по всей молекуле, что открывает возможность мониторинга всех фрагментов, образующихся при их протеолитическом гидролизе в тканях организма.

Эта реакция была использована при синтезе меченого по тритию дипептида ЦПГ с молярной радиоактивностью 54 Ки/моль, что позволило использовать его для проведения фармакокинетических исследований на экспериментальных животных.

На рисунке 3 приведена типичная хроматограмма, полученная в ходе анализа ЦПГ в пептидных экстрактах из образцов крови.

В результате проведённого анализа были рассчитаны значения концентрации ЦПГ в цельной венозной крови крысы при однократном внутривенном болюсном введении (табл. 1).

Для расчёта фармакокинетических параметров был использован модельный подход. Минимальная ФК-модель, пригодная для описания полученных экспериментальных данных – открытая двухкамерная модель с элиминацией пептида из центральной камеры (рис. 4).

Это хорошо видно из графического представления данных (концентрация/время) в прямых и полулогарифмических координатах (рис. 5).

Убывающая моноэкспоненциальная зависимость используется для математического описания однокамерной ФК-модели, а убывающая биэкспоненциальная зависимость – для описания простейшей двухкамерной ФК-модели (рис. 1). Уравнения убывающих монои биэкспоненциальных зависимостей можно представить в виде:

Ct = A·exp(-α·t)  (1)

Ct = A·exp(-α·t) + B·exp(-β·t)        (2)

где: Ct – концентрация фармакологического вещества в крови в момент времени t; а A, B, α и β – гибридные константы (макроконстанты) интегральных уравнений (1) и (2).

В случае биэкспоненциальной зависимости (двухкамерная модель) первая экспонента (макроконстанты A и α) в основном отражает процесс распределения вещества между центральной и периферической камерами, а вторая экспонента (макроконстанты B и β) – процесс элиминации вещества из центральной камеры.

Для наилучшей подгонки значений параметров уравнений (1) и (2) (макроконстант) экспериментальным данным применяли нелинейную регрессию и метод наименьших квадратов с помощью Sigma Plot 11.0.

Корректность применения той или иной модели для описания имеющихся экспериментальных данных была оценена с помощью коэффициента детерминации (r2) и скорректированного коэффициента детерминации (adjusted r2). Значения этих и некоторых других показателей для двух рассматриваемых моделей приведены в таблице 2. Представленные результаты указывают на то, что экспериментальные данные хорошо описываются биэкспоненциальной зависимостью (уравнение (2)). Следовательно, полученные экспериментальные данные (табл. 2) корректно анализировать в рамках двухкамерной ФК-модели.

С использованием нелинейной регрессии определены значения макроконстант в уравнении (2) (табл. 3).

Исходя из значений макроконстант были рассчитаны значения микроконстант k10, k12 и k21 (см. схему на рис. 1), периодов полуэлиминации фазы распределения (T1/2α) и фазы элиминации (T1/2β) и ряд системных ФК-параметров (табл. 4).

Усреднённая концентрационная кривая [3H]ЦПГ и рассчитанные из неё фармакокинетические параметры исследуемого соединения в крови животных после однократного внутривенного введения (в/в) представлены на рис. 5 и в табл. 4. [3H]ЦПГ определялся в крови на протяжении 90 минут. Кажущаяся начальная концентрация (С0) ЦПГ в плазме крови крыс составила 25,01 нг/мл. Его период полуэлиминации (T1/2β) составил 79,7 минут.

Ранее на крысах была изучена фармакокинетика соединения дипептидной структуры – ноопепта, обладающего ноотропной активностью. В результате исследования биотрансформации ноопепта были установлены химические структуры его метаболитов. Среди основных продуктов биотрансформации был обнаружен циклопролилглицин [1].

Величина периода полуэлиминации (T1/2el) ЦПГ после в/в способа введения ноопепта крысам в дозе 5 мг/кг составила 2,65 ч (159 мин) и MRT – 2,52 ч (151,2 мин) [15]. Следовательно, T 1/2el ЦПГ после в/в введения ноопепта значительно больше аналогичного параметра незамещенных дии трипептидов.

Например, период полуэлиминации пептидного соединения – анксиолитика ГБ-115 у крыс после его перорального введения в дозе 100 мг/кг составил 0,24 ч (14,4 мин) и MRT – 0,28 ч (16,8 мин) [16].

Величина T1/2el другого пептидного вещества – нейролептика дилепта у крыс после его перорального введения в дозе 200 мг/кг составила 0,55 ч (33,0 мин) и MRT – 0,85 ч (51,0 мин) [17].

Учитывая, что период полуэлиминации ЦПГ после его в/в введения составил около 80,0 минут, ЦПГ можно отнести к группе «долгоживущих» лекарственных веществ пептидной природы. Такие ФК-параметры, как T1/2elи среднее время удерживания вещества в организме (MRT – 111,2 мин) указывают на относительно долгое нахождение исследуемого вещества в системном кровотоке животных.

Таким образом, ЦПГ в сравнении с другими пептидными соединениями более длительно выводится из организма крыс как в качестве метаболита, образующегося после введения ноопепта, так и при непосредственном его введении как лекарственного вещества.

Выводы

1. Реакцией ВТКИО с тритием получен меченый тритием пептид ЦПГ с молярной радиоактивностью 54 Ки/ммоль и радиохимической чистотой более 98 %, что позволило использовать его для проведения фармакокинетических исследований на экспериментальных животных.

2. C использованием радиоактивномеченного тритием производного проведено исследование фармакокинетики [3Н]-ЦПГ в крови крысы при однократном внутривенном болюсном введении пептида. Показано, что изменение   концентрации [3Н]-ЦПГ в крови (во времени) соответствует двухкамерной ФК-модели, описываемой двухэкс поненциальным уравнением. Это может быть обусловлено наличием достаточно ёмкого депо ЦПГ, характеризующегося относительно медленным накоплением и высвобождением пептида.

3. На основе модельного подхода рассчитаны значения модель-зависимых параметров (микроконстанты k10, k12 и k21) и системных фармакокинетических параметров (AUC, MRT, kel, ClT, Vd). Они свидетельствуют об относительно низкой скорости элиминации (kel) и о продолжительном времени удерживания [3Н]-ЦПГ в организме – 0,03 мин-1 и 111 мин соответственно.

4. После однократного внутривенного болюсного введения в дозе 5,7 мг/кг ЦПГ в организме крыс определяется на протяжении 90 минут. Величина периода полувыведения ЦПГ из крови составила 80 минут и среднего времени удерживания вещества в организме – 111 минут.

5. Большой период полувыведения [3Н]-ЦПГ в β-фазе позволяет отнести его к относительно долгоживущим соединениям с пептидной структурой.

Список литературы

1. Бойко С.С., Жердев В.П., Гудашева Т.А., и др. Фармакокинетика нового потенциального дипептидного ноотропного препарата ГВС-111 и его метаболитов в мозге крыс // Химико-фармацевтический журнал. - 2001. - № 9. - С.11-13. DOI: 10.1023/A:1014082406443

2. Gudasheva TA, Boyko SS, Ostrovskaya RU, et al. Identification of a novel endogenous memory facilitating cyclic dipeptide cyclo-prolylglycine in rat brain. FEBS Letters. 1996; 391:149- 152. DOI: 10.1016/0014-5793(96)00722-3

3. Гудашева Т.А., Островская Р.У., Трофимов С.С., и др. Новый эндогенный дипептид циклопролилглицин подобен пирацетаму по селективности мнемотропного эффекта // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1999. - Т. 128. - № 10 - С.411-413.

4. Гудашева Т.А., Константинопольский М.А., Островская Р.У., и др. Анксиолитическая активность эндогенного ноотропного пептида циклопролилглицина в тесте приподнятого крестообразного лабиринта // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - Т.131. - № 5 - С.464- 466.

5. Колясникова К.Н., Гудашева Т.А., Назарова Г.А., и др. Сходство цикло-пролилглицина с пирацетамом по антигипоксическому и нейропротекторному эффектам // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2012. - Т. 75. - № 9 - С.3-6.

6. Гудашева Т.А., Колясникова К.Н., Антипова Т.А., и др. Нейропептид циклопролилглицин увеличивает содержание мозгового нейротрофического фактора в нейрональных клетках // Доклады академии наук. - 2016. - Т. 469. - №4 - С.492- 495. DOI: 10.7868/S0869565216220254

7. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. / Под ред. Миронова А.Н. Часть первая. -М.: Гриф и К.; 2012. с. 944.

8. Национальный стандарт Российской федерации, ГОСТ Р. 53434 - (2009).

9. Malavolta L., Cabra FR. Peptides: Important tools for the treatment of central nervous system disorders. Neuropeptides. 2011 ;45(5):309- 316. DOI: 10.1016/j.npep.2011.03.001

10. Diao L., Meibohm B. Pharmacokinetics and pharmacokinetic-pharmacodynamic correlations of therapeutic peptides. Clinical Pharmacokinetics. 2013;52(10):855- 868. DOI: 10.1007/s40262-013-0079-0

11. Zolotarev YuA, Dadayan AK, Bocharov EV, et al. New development in the tritium labelling of peptides and proteins using solid catalytic isotopic exchange with spillover-tritium. Amino Acids. 2003; 24(3): 325- 333. DOI: 10.1007/s00726-002-0404-7

12. Золотарев Ю.А., Дадаян А.К., Долотов О.В., и др. Равномерно меченные тритием пептиды в исследованиях по их биодеградации in vivo и in vitro // Биоорганическая химия. - 2006. - Т. 32. - №2 - С.183-191.

13. Zolotarev YuA, Dadayan AK, Kozik VS, et al. Solid-state isotope exchange with spillover hydrogen in organic compounds. Chem. Rev. 2010;110(9):5425- 5446. DOI: 10.1021/cr100053w

14. Zolotarev YuA, Dadayan AK, Borisov YuA, et al. New development in the solid-state isotope exchange with spillover hydrogen in organic compounds. J. Phys. Chem. C. 2013; 117(33):16878- 16884. DOI: 10.1021/jp4015299

15. Коротков С.А. Экспериментальное изучение фармакокинетики и биотрансформации нового дипептидного ноотропа ноопепта. Дис. канд. биол. наук. - М.; 2003. Доступно по: http:// medical-diss.com/medicina/eksperimentalnoe-izuchenie-farmakokinetiki-i-biotransformatsii-novogo-dipeptidnogo-nootropa-noopepta

16. Раскин С.Ю., Колыванов Г.Б., Литвин А.А., и др. Фармакокинетика дипептидного анксиолитика ГБ-115 после перорального введения у различных видов животных и человека // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2017. - №3. - С.20- 25.

17. Шевченко Р.В., Литвин А.А., Колыванов Г.Б., и др. Особенности фармакокинетики оригинального нейролептика дилепта у животных и человека // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2014. - Т77. - №7. - С.23- 26. DOI: https:// doi.org/10.30906/0869-2092-2014-77-7-23-26


Об авторах

Георгий Иванович Ковалёв
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»
Россия


Юрий Александрович Золотарёв
ФГБУН «Институт молекулярной генетики»
Россия


Александр Каренович Дадаян
ФГБУН «Институт молекулярной генетики»
Россия


Станислав Иванович Шрам
ФГБУН «Институт молекулярной генетики»
Россия


Алия Анвяровна Абдуллина
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»
Россия


Екатерина Валерьевна Васильева
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»
Россия


Геннадий Борисович Колыванов
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»
Россия


Владимир Павлович Жердев
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»
Россия


Для цитирования:


Ковалёв Г.И., Золотарёв Ю.А., Дадаян А.К., Шрам С.И., Абдуллина А.А., Васильева Е.В., Колыванов Г.Б., Жердев В.П. Изучение фармакокинетики [3Н]-циклопролилглицина в крови крыс. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2018;(3):48-56. https://doi.org/ 10.24411/2587-7836-2018-10024.

For citation:


Kovalev G.I., Zolotarev Yu.A., Dadayan A.K., Shram S.I., Abdullina A.A., Vasileva E.V., Kolyvanov G.B., Zherdev V.P. The Study of [3H]-Cycloprolylglycine Pharmacokinetics in Rat Blood. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2018;(3):48-56. (In Russ.) https://doi.org/ 10.24411/2587-7836-2018-10024.

Просмотров: 79


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2587-7836 (Print)
ISSN 2686-8830 (Online)