Введение

Циклопролилглицин (ЦПГ, цикло-(Про-Гли)) был сначала описан в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова в качестве одного из основных метаболитов препарата ноопепт [1].

Впоследствии ЦПГ был обнаружен в мозге крыс с помощью ВЭЖХ и ГЖХ, а также масс-спектрометрического анализа с ионизацией электронным ударом в качестве эндогенного соединения, средняя концентрация которого составила 2,8 ± 0,3 нмоль/г сырой ткани [2]. Фармакологическое изучение позволило выявить у него антиамнестическую [3], анксиолитическую [4], антигипоксическую, нейропротекторную [5] активности, которые он проявляет в диапазоне доз от 0,05 до 1 мг/кг. Помимо этого, ЦПГ увеличивал содержание нейротрофина BDNF в культурах гиппокампальных мышиных клеток линии HT-22 и клеток нейробластомы человека линии SH-SY5Y как в норме, так и при моделировании повреждения с помощью глутамата и 6-гидроксидофамина [6].

Целью настоящего исследования стало изучение фармакокинетики пептида циклопролилглицин с использованием его радиоактивномеченного тритием производного [G-3Н]-ЦПГ.

Материалы и методы

Получение радиоактивномеченного тритием пептида ЦПГ. Реакцию ВТКИО с газообразным тритием проводили при температуре 170 °С в твёрдой смеси, образованной ЦПГ, нанесённым на неорганический носитель, и высокодисперсным катализатором платиновой группы. ЦПГ в количестве 1,0 мг растворяли в 1 мл воды и смешивали с 20 мг неорганического носителя. Воду удаляли при уменьшенном давлении при 20 °С. Неорганический носитель с нанесённым препаратом смешивали с 10 мг гетерогенного катализатора платиновой группы. В ампулу объёмом 10 мл помещали полученную твёрдую смесь, вакуумировали, заполняли газообразным тритием до давления 250 торр и проводили реакцию ВТКИО при повышенной температуре. Ампулу охлаждали, вакуумировали, продували водородом. Пептид десорбировали 20 % водным этанолом. Для удаления лабильного трития меченый пептид ещё дважды растворяли в 20 % водном этаноле и упаривали досуха. Хроматографическую очистку проводили с помощью ВЭЖХ на колонке Кромасил в градиенте метанола в присутствии 0,1 % трифторуксусной кислоты (рис. 1). Пептид упаривали и растворяли в этаноле до радиоактивной концентрации 1 мКи/мл. Реакцией ВТКИО с тритием были получен меченый тритием пептид [3H]-ЦПГ с молярной радиоактивностью 54 Ки/ммоль в количестве 20 мКи и радиохимической чистотой более 98 %, с использованием уникальной установки по обмену водорода на тритий ОВТ-1 (Отдел химии физиологически активных веществ ИМГ РАН).

Животные и их содержание. В исследованиях использовали здоровых половозрелых крыс-самцов линии Вистар (n = 3), весом 340 ± 10 г. Содержание животных соответствовало действующим санитарным правилам по содержанию лабораторных животных. Исследование выполнялось согласно Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств [7] и Правилам лабораторной практики в Российской Федерации [8]. Все процедуры в исследовании выполнялись согласно утверждённым Комиссией по гуманному обращению с животными протоколам.

Введение животным пептида ЦПГ и отбор крови. Введение пептида ЦПГ и отбор крови осуществляли через ярёмные вены. Перед введени ем пептида крыс анестезировали смесью кетамина (91 мг/кг) и ксилазина (9,1 мг/кг), после чего с вентральной стороны справа и слева препарировали две ярёмные вены и устанавливали внутривенные катетеры, слева – FlexicathG24 (Apexmed, Нидерланды), а в правую – FlexicathG22 (Apexmed, Нидерланды). В левую ярёмную вену вводили 80 мкл гепарина и затем в течение 10-15 с – раствор радиоактивно меченого пептида ЦПГ (2000 мкКи, 5,7 мг/кг) в объеме 200 мкл. По истечении определенного времени (1; 2,5; 4; 6; 10; 20; 40; 60 и 90 мин) из правой ярёмной вены отбирали примерно по 0,4 мл венозной крови, которую помещали в пластиковые пробирки и быстро замораживали в жидком азоте.

Анализ содержания пептида [3H]-ЦПГ в образцах крови. При приготовлении препаратов для ВЭЖХ анализа замороженные и взвешенные образцы крови в пластиковых пробирках подвергались лиофильной сушке в течение 2 суток. После чего, высушенные образцы прогревались для удаления пептидазной активности тканей. Для приготовления пептидного экстракта проводили последовательные экстракции органическими растворителями, упаривание под уменьшенным давлением и центрифугирование. Лиофильно высушенные образцы крови прогревали при 65 °С в течение 30 минут, после чего образцы измельчались в этих же пластиковых пробирках горизонтальными ножами, вращающимися со скоростью 5000 об./мин. Первую экстракцию этих образцов проводили 90 % водным ацетонитрилом, содержащим 1 % трифторуксусной кислоты. После центрифугирования раствор, содержащий меченый тритием пептид и компоненты плазмы крови, подвергался сушке под уменьшенным давлением, реэкстракции метанолом и повторному центрифугированию. Полученный при этом раствор, содержащий меченый тритием пептид и компоненты плазмы крови, подвергался сушке под уменьшенным давлением, реэкстракции 0,1 % водным раствором гептафтормасляной кислоты и последующему центрифугированию.

Радиохроматографический анализ проводили с помощью ВЭЖХ на колонке Кромасил С18,5 мкм, 150 х 4 мм в присутствии 0,1 % трифторуксусной кислоты. Выбраны условия анализа с помощью ВЭЖХ, позволяющие выделить фракцию, соответствующую ЦПГ, и отделить дипептиды PG и GР, являющиеся возможными пептидными метаболитами протеолитического гидролиза (рис. 2).

Хроматографические фракции, соответствующие пептиду ЦПГ, собирали и анализировали с помощью жидкостного сцинтилляционного счётчика TriCarb 2900TR (“PerkinElmer”) с эффективностью счёта 45 %. Количественные значения радиоактивномеченого ЦПГ в пробе нормировали по внутреннему стандарту.

Анализ фармакокинетических данных. Анализ фармакокинетических параметров ЦПГ проводили в рамках модельного подхода согласно Рекомендациям по проведению доклинических исследований [7]. Для расчётов параметров и построения графиков использовали программу Sigma Plot 11.0. Фармакокинетические кривые («концентрация ЦПГ-время») для расчёта фармакокинетических параметров были построены по усреднённым значениям концентраций ЦПГ в крови, полученным из данных для 3 животных.

Результаты и обсуждение

Соединения пептидной природы находят все большее применение при разработке новых лекарственных препаратов [9, 10]. Важными их преимуществами являются высокая эффективность и чрезвычайно низкая токсичность. Однако исследование их фармакокинетических свойств сопряжено с целым рядом проблем. Прежде всего это обусловлено их быстрой деградацией в тканях и образованием множества метаболитов. Уникальные возможности для получения корректных результатов при анализе фармакокинетики пептидов даёт использование равномерно меченных изотопами водорода пептидов, содержащих изотопную метку во всех аминокислотных остатках [11]. Для получения таких пептидов ранее было предложено использовать реакцию высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) [12, 13]. В Отделе химии физиологически активных соединений Института молекулярной генетики РАН в течение ряда лет проводятся исследования по изучению твёрдофазных каталитических реакций с изотопами водорода, получившие признание в нашей стране и за рубежом. Важной особенностью реакции ВТКИО является то, что изотопный обмен в пептидах и белках происходит с сохранением их биологических свойств [14]. Метод позволяет получать изотопномеченные белки и пептиды, в которых атомы изотопов распределены по всей молекуле, что открывает возможность мониторинга всех фрагментов, образующихся при их протеолитическом гидролизе в тканях организма.

Эта реакция была использована при синтезе меченого по тритию дипептида ЦПГ с молярной радиоактивностью 54 Ки/моль, что позволило использовать его для проведения фармакокинетических исследований на экспериментальных животных.

На рисунке 3 приведена типичная хроматограмма, полученная в ходе анализа ЦПГ в пептидных экстрактах из образцов крови.

В результате проведённого анализа были рассчитаны значения концентрации ЦПГ в цельной венозной крови крысы при однократном внутривенном болюсном введении (табл. 1).

Для расчёта фармакокинетических параметров был использован модельный подход. Минимальная ФК-модель, пригодная для описания полученных экспериментальных данных – открытая двухкамерная модель с элиминацией пептида из центральной камеры (рис. 4).

Это хорошо видно из графического представления данных (концентрация/время) в прямых и полулогарифмических координатах (рис. 5).

Убывающая моноэкспоненциальная зависимость используется для математического описания однокамерной ФК-модели, а убывающая биэкспоненциальная зависимость – для описания простейшей двухкамерной ФК-модели (рис. 1). Уравнения убывающих монои биэкспоненциальных зависимостей можно представить в виде:

Ct = A·exp(-α·t)  (1)

Ct = A·exp(-α·t) + B·exp(-β·t)        (2)

где: Ct – концентрация фармакологического вещества в крови в момент времени t; а A, B, α и β – гибридные константы (макроконстанты) интегральных уравнений (1) и (2).

В случае биэкспоненциальной зависимости (двухкамерная модель) первая экспонента (макроконстанты A и α) в основном отражает процесс распределения вещества между центральной и периферической камерами, а вторая экспонента (макроконстанты B и β) – процесс элиминации вещества из центральной камеры.

Для наилучшей подгонки значений параметров уравнений (1) и (2) (макроконстант) экспериментальным данным применяли нелинейную регрессию и метод наименьших квадратов с помощью Sigma Plot 11.0.

Корректность применения той или иной модели для описания имеющихся экспериментальных данных была оценена с помощью коэффициента детерминации (r2) и скорректированного коэффициента детерминации (adjusted r2). Значения этих и некоторых других показателей для двух рассматриваемых моделей приведены в таблице 2. Представленные результаты указывают на то, что экспериментальные данные хорошо описываются биэкспоненциальной зависимостью (уравнение (2)). Следовательно, полученные экспериментальные данные (табл. 2) корректно анализировать в рамках двухкамерной ФК-модели.

С использованием нелинейной регрессии определены значения макроконстант в уравнении (2) (табл. 3).

Исходя из значений макроконстант были рассчитаны значения микроконстант k10, k12 и k21 (см. схему на рис. 1), периодов полуэлиминации фазы распределения (T1/2α) и фазы элиминации (T1/2β) и ряд системных ФК-параметров (табл. 4).

Усреднённая концентрационная кривая [3H]ЦПГ и рассчитанные из неё фармакокинетические параметры исследуемого соединения в крови животных после однократного внутривенного введения (в/в) представлены на рис. 5 и в табл. 4. [3H]ЦПГ определялся в крови на протяжении 90 минут. Кажущаяся начальная концентрация (С0) ЦПГ в плазме крови крыс составила 25,01 нг/мл. Его период полуэлиминации (T1/2β) составил 79,7 минут.

Ранее на крысах была изучена фармакокинетика соединения дипептидной структуры – ноопепта, обладающего ноотропной активностью. В результате исследования биотрансформации ноопепта были установлены химические структуры его метаболитов. Среди основных продуктов биотрансформации был обнаружен циклопролилглицин [1].

Величина периода полуэлиминации (T1/2el) ЦПГ после в/в способа введения ноопепта крысам в дозе 5 мг/кг составила 2,65 ч (159 мин) и MRT – 2,52 ч (151,2 мин) [15]. Следовательно, T 1/2el ЦПГ после в/в введения ноопепта значительно больше аналогичного параметра незамещенных дии трипептидов.

Например, период полуэлиминации пептидного соединения – анксиолитика ГБ-115 у крыс после его перорального введения в дозе 100 мг/кг составил 0,24 ч (14,4 мин) и MRT – 0,28 ч (16,8 мин) [16].

Величина T1/2el другого пептидного вещества – нейролептика дилепта у крыс после его перорального введения в дозе 200 мг/кг составила 0,55 ч (33,0 мин) и MRT – 0,85 ч (51,0 мин) [17].

Учитывая, что период полуэлиминации ЦПГ после его в/в введения составил около 80,0 минут, ЦПГ можно отнести к группе «долгоживущих» лекарственных веществ пептидной природы. Такие ФК-параметры, как T1/2elи среднее время удерживания вещества в организме (MRT – 111,2 мин) указывают на относительно долгое нахождение исследуемого вещества в системном кровотоке животных.

Таким образом, ЦПГ в сравнении с другими пептидными соединениями более длительно выводится из организма крыс как в качестве метаболита, образующегося после введения ноопепта, так и при непосредственном его введении как лекарственного вещества.

Выводы

1. Реакцией ВТКИО с тритием получен меченый тритием пептид ЦПГ с молярной радиоактивностью 54 Ки/ммоль и радиохимической чистотой более 98 %, что позволило использовать его для проведения фармакокинетических исследований на экспериментальных животных.

2. C использованием радиоактивномеченного тритием производного проведено исследование фармакокинетики [3Н]-ЦПГ в крови крысы при однократном внутривенном болюсном введении пептида. Показано, что изменение   концентрации [3Н]-ЦПГ в крови (во времени) соответствует двухкамерной ФК-модели, описываемой двухэкс поненциальным уравнением. Это может быть обусловлено наличием достаточно ёмкого депо ЦПГ, характеризующегося относительно медленным накоплением и высвобождением пептида.

3. На основе модельного подхода рассчитаны значения модель-зависимых параметров (микроконстанты k10, k12 и k21) и системных фармакокинетических параметров (AUC, MRT, kel, ClT, Vd). Они свидетельствуют об относительно низкой скорости элиминации (kel) и о продолжительном времени удерживания [3Н]-ЦПГ в организме – 0,03 мин-1 и 111 мин соответственно.

4. После однократного внутривенного болюсного введения в дозе 5,7 мг/кг ЦПГ в организме крыс определяется на протяжении 90 минут. Величина периода полувыведения ЦПГ из крови составила 80 минут и среднего времени удерживания вещества в организме – 111 минут.

5. Большой период полувыведения [3Н]-ЦПГ в β-фазе позволяет отнести его к относительно долгоживущим соединениям с пептидной структурой.