Синергидные нейропротекторные эффекты тиамина, пиридоксина и цианокобаламина в рамках протеома человека

Введение

Витамины группы В реализуют свои нейрофизиологические роли за счёт поддержания активности определённых ферментов и других разновидностей белков, входящих в протеом человека. Активность белков протеома зависит от множества кофакторов и, в частности, от витаминов В1, В6 и В12. Например, синтез АТФ осуществляется посредством ферментов, кофакторами которых являются тиамин фосфат и пиридоксаль фосфат [1]. Кроме того, молекулярно-биологические роли витамина В6 (производное пиридоксина) включают метаболизм аминокислот, синтез нейротрансмиттеров, биосинтез других витаминов. Витамин В12 необходим для поддержания метаболизма фолатов, обезвреживания гомоцистеина и др.

Дефициты эти витаминов приводят к развитию неврологических заболеваний. Например, глубокий дефицит витамина В1 у пациентов с алкоголизмом приводит к развитию синдрома С.С. Корсакова, характеризующегося снижением памяти на ближайшие события, депрессией, плаксивостью и демиелинизацией [2].

Для оценки реального масштаба воздействия витаминов В1, В6 и В12 на организм человека следует рассмотреть их эффекты в постгеномной перспективе (рис. 1), т. е. в рамках воздействия на геном (совокупность всех генов организма), транскриптом (совокупность всех РНК), протеом (совокупность всех белков) и метаболом (совокупность всех метаболитов) [3].

Важно отметить, что за широкий круг биологических ролей витаминов В1, В6, В12 отвечают специфические взаимодействия производных этих витаминов именно с белками протеома. Пиридоксин, тиамин, цианокобаламин не взаимодействуют ни с геномной ДНК, ни с РНК транскриптома, а продукты биотрансформаций молекул провитаминов и активных форм витаминов просто являются отдельными метаболитами из метаболома. В то же время, проведённые нами поиски по базам данных протеома человека (NCBI PROTEIN, EMBL, UNIPROT, Human Proteome Map (HPM), BIOCYC-HUMAN и др.) показали, что в протеоме человека существуют 78 витамин-В6-зависимых белков, 22 витамин-В1-зависимых белков, и 24 витамин-В12-зависимых белков (см. рис. 1). Системно-биологический анализ этих массивов белков позволяет провести комплексную системно-биологическую оценку всех возможных биологических эффектов сочетания витаминов В1, В6, В12, и, соответственно, оценить спектр клинических применений синергидного сочетания этих витаминов.

Материалы и методы

Списки из 22 витамин-В1-зависимых белков, 78 витамин-В6-зависимых белков, и 24 витамин-В12-зависимых белков (включая белки метаболизма и транспорта перечисленных витаминов), составленные на основе имеющихся аннотаций генома человека в базах данных NCBI PROTEIN, EMBL, UNIPROT и HPM, анализировались посредством метода функционального связывания [3]. Анализ функциональных взаимосвязей — одна из информационных технологий современной биоинформатики. Данный метод основан на системном рассмотрении органов, тканей, клеток и их мельчайших компонентов — белков, ДНК, метаболитов (в т. ч. витаминов и других микронутриентов), в рамках фундаментальных основ молекулярной биологии и биохимии. Так, на основе информации определённой геномной ДНК синтезируется соответствующий белок, выполняющий строго очерченный круг специфических функций. Как врождённые мутации гена, так и дефициты кофакторов белка (витаминов В1, В6, В12 других витаминов и минералов) будут приводить к падению активности тех или иных белков и проявлению той или иной специфической неврологической симптоматики (рис. 2).

Метод анализа функциональных взаимосвязей, соединяя данные различных уровней информации (данные о моногенных заболеваниях, биохимические данные о кофакторах белков, данные о клеточных ролях белков, симптоматику и критерии диагностики заболеваний и т. д.) в различных базах данных (БД), позволяет систематически рассмотреть все возможные биологические роли витаминов В1, В6, В12 и их синергидных сочетаний. В целом, при использовании метода анализа функциональных взаимосвязей (см. рис. 2) каждый белок протеома человека представлен строкой в списке, включающем такие описания белка/гена как:

•аминокислотная последовательность белка;

•список эссенциальных кофакторов белка (в т. ч. с указанием потребности в производных витаминов В1, В6, В12 для активности рассматриваемого белка);

•список моногенных заболеваний, связанных с полной или частичной потерей активности этого белка и соответствующего гена;

•список клинических симптомов рассматриваемых моногенных заболеваний; 

•список клеточных функций белка (по БД Gene Ontology, GO и др.);

•список отдельных симптомов заболеваний, список диагнозов по МКБ-10 и другая информация из баз данных.

Далее, в полученном списке выделяются гены, соответствующие белкам из списка витамин-В1-зависимых белков и др. и проводятся последующие анализы биологических ролей этих белков на основании статистических критериев. Для статистической обработки результатов исследования использовались методы математической статистики, включающие расчёт числовых характеристик случайных величин, проверки статистических гипотез с использованием параметрических и непараметрических критериев, корреляционного и дисперсионного анализа. Сравнение прогнозируемых и наблюдаемых частот встречаемости исследуемых признаков проводилось с помощью критерия %-квадрат, критерия Вилкоксона— Манна-Уитни и теста Стьюдента. Для статистической обработки материала использовалась прикладная программа STATISTICA 6.0 и электронные таблицы Microsoft Excel.

Результаты

В результате проведённого анализа, среди известных 50 057 белков протеома человека было выделено 20 180 аннотированных белков протеома (т. е. белков, для которых известны хотя бы основные биологически роли). Среди 20 180 белков, 78 являлись витамин-В6-зависимыми, 22 — витамин-В1-зависимыми, и 24 — витамин-В12-зависимыми белками. Рассмотрение всего массива этих белков в рамках настоящей статьи не представляется возможным. Поэтому, рассмотрим различные способы системно-биологической группировки этих белков в соответствии с различными международными рубрикаторами биологических ролей белков и системой классификации заболеваний МКБ-10.

Анализ нейробиологических и клинических эффектов витамин-В1 -зависимых белков

Анализ витамин-В1-зависимых белков, аннотированных в соответствии с международной номенклатурой Gene Ontology (GO) позволил установить ней робиологические роли белков, ассоциированных с эффектами тиамина (табл. 1). 

Анализ перечисленных в табл. 1 биологических ролей В1-зависимых белков позволил выделить 4 основных направления воздействия тиамина на организм:

•Неврологические роли (миелиновая оболочка, активация сигнального пути рецептора аденозина, метаболизм аденозина, развитие пирамидальных нейронов, развитие таламуса, развитие гиппокампа, развитие стриатума, развитие коры мозжечка);

•Энергетический метаболизм клетки и синтез АТФ (митохондрия, митохондриальная а-кетоглутарат дегидрогеназа, цикл Кребса, пируватдегидрогеназа, оксоглутарат дегидрогеназа, связывание иона магния);

•Метаболизм углеводов (гликолиз, метаболизм глюкозы, транскетолаза), жиров (а-окисление жирных кислот), аминокислот (катаболизм аминокислот с разветвленной цепью);

•Кроветворение (транспортер фолатов, дифференцировка клеток при гемопоэзе).

Далее рассмотрим, как витамин В1 влияет на более «крупные» фрагменты метаболизма — внутриклеточные сигнальные каскады, биосинтетические каскады и другие элементы реактома человека (как известно, реактом — совокупность всех химических реакций, протекающих в нейронах, других клетках и в межклеточном пространстве с участием элементов протеома и метаболома).

Данный анализ был проведён с использованием аннотаций белков протеома человека, приведённых в базе данных REACTOME (рис. 3). Результаты анализа подтверждают приведённую выше рубрикацию биологический ролей тиамина и указывают на дополнительные механизмы действия тиамина (передача сигналов ретиноидов). Заметим, что потеря памяти при синдроме С.С.Корсакова ассоциирована с авитаминозом В: и, в частности, с нарушениями метаболизма аминокислот с разветвлённой цепью. Как известно, для восстановления памяти назначаются фармакологические дозы витамина В1 (50—100 мг/сут).

Описанный выше весьма обширный спектр нейробиологических ролей В1-зависимых белков обуславливает не менее широкий спектр заболеваний. Анализ данных симптомов с учётом данных, представленных в базах данных OMIM, ORPHA, ICD-10, позволил выделить диагнозы по МКБ-10, специфически ассоциированные с B1-зависимыми белками (рис. 4). Заметим, что практически все перечисленные заболевания, ассоциированные с недостаточностью витамина В1, имеют неврологическую симптоматику. Например, любая форма анемии, особенно тиамин-зависимая мегалобластная анемия, ассоциирована с головокружением, апатией, астенией, снижением памяти и пр. вследствие хронической гипоксии мозга.

Дефицит В1 во время беременности ассоциирован с аномалиями развития (в т. ч. микроцефалией, дистрофией мышц, энцефалопатией). Низкая обеспеченность витамином В1 ассоциирована с такими заболеваниями, как E74, расстройство обмена пирувата, E71 Болезнь «кленового сиропа мочи», E88 Оксоглутаратацидурия, G31 Синдром Ли с кардиомиопатией, также характеризующихся тяжёлой неврологической симптоматикой.

Подчеркнём, что перечисленные симптомы и заболевания ассоциированы с нуклеотидными дефектами генов, кодирующих обсуждаемые В1-зависимые белки протеома (см. Методы). Однако, поскольку биологическая активность этих белков в существенной мере зависит от обеспеченности организма витамином В1, то дефицит этого витамина будет приводить к симптоматике, схожей с описанными проявлениями генетических дефектов. Заметим, что течение этих врождённых заболеваний значительно утяжеляется на фоне дефицита витамина В1, а для компенсации потребности в витамине В1 у таких пациентов используются более высокие дозы [2].

Анализ нейробиологических и клинических эффектов витамин-В6 -зависимых белков

Анализ биологических ролей В6-зависимых белков, аннотированных в соответствии с международной номенклатурой Gene Ontology (GO) позволил установить нейробиологические роли белков, ассоциированные с эффектами пиридоксаль-5-фосфата — основной биологически активной формы витамина В6 (табл. 2).

Анализ перечисленных в табл. 2 биологических ролей В6-зависимых белков показал, что витамин В6, связывающийся с белками в виде кофактора пиридоксаль-5-фосфата, оказывает следующие воздействия витамина В6 на организм:

•Неврологические роли (биосинтез сфинголипидов, биосинтез ГАМК, миелин);

•Метаболизм аминокислот (L-цистеина, L-фенилаланина, L-аланина, L-аспартата, L-серина, L-глутамата, L-триптофана, L-лизина, активность трансаминазы);

•Энергетический метаболизм клетки и синтез АТФ (ответ на гипоксию, митохондриальный матрикс, метаболизм 2-оксоглутарата, метаболизм глиоксилата, биосинтез пирувата, глюконеогенез, катаболизм гликогена);

•Синергидные пиридоксину микронутриенты (магний, тетрагидрофолат, гем, селен, НАДФ, молибдоптерин).

Эти биологические роли витамин-В6-зависимых белков обуславливают определённый спектр врождённых заболеваний, специфически ассоциированных с нарушениями активации В6-зависимых белков протеома человека. Анализ таких заболеваний на основе данных, представленных в базах данных OMIM, ORPHA, ICD-10, позволил выделить диагнозы по МКБ-10, специфически ассоциированные с В6-зависимыми белками протеома человека. Так, дефицит активности пиридоксин-зависимых белков был достоверно ассоциирован с нарушениями метаболизма аминокислот (E72 Другие нарушения обмена аминокислот; E70 Нарушения обмена ароматических аминокислот; G40 Эпилепсия), нарушениями кроветворения (D58 Другие наследственные гемолитические анемии, D72 Другие нарушения белых кровяных клеток) и др. (табл. 3, рис. 5). 

Анализ нейробиологических и клинических эффектов витамин-В12 -зависимых белков

Анализ биологических ролей 24 витамин-В12-зависимых белков, аннотированных в соответствии с международной номенклатурой Gene Ontology (GO) позволил установить биологические роли белков, ассоциированные с эффектами витамина В12 (табл. 4). При этом важно отметить, что цианкобаламин является кофактором всего двух ферментов — метилмалонил-КоА мутазы митохондрий (участвует в деградации аминокислот, жирных кислот, холестерина в цикле Кребса) [4] и метионин синтетазы (обезвреживает гомоцистеин). Остальные белки либо вовлечены в транспорт, биотрансформации и выведение производных витамина В12, либо витамин В12 непосредственно влияет на экспрессию этих белков.

Анализ перечисленных в таблице биологических ролей В12-зависимых белков показал, что витамин В12 оказывает следующие воздействия на организм:

• Метаболизм жиров (метаболизм липопротеинов, метаболизм холестерина, катаболизм жирных кислот с короткой цепью, пищеварение). Нарушение активности соответствующих белков клинически выражается формированием про-атеросклеротического липидного профиля.  

•Кроветворение (дифференцировка гемопоэтических клеток-предшественников, метилирование ДНК, переработка гомоцистеина, метаболизм кобаламина, метаболизм фолатов). Нарушение активности соответствующих белков соответствует формированию В12-зависимой анемии.

•Нейропротекторный и нейротрофический эффекты (ответ на повреждение аксонов, регенерация аксонов, клеточный ответ на оксид азота NO, метаболизм глутатиона). При дефиците витамина В12 активность соответствующих белков нарушается, что снижает выживаемость нейронов и способствует ишемизации нервной ткани.

•Метаболизм микронутриентов (метаболизм кобаламина, метаболизм фолатов, метаболизм витамина D, биосинтез гема). Нарушение активности соответствующих белков будет приводить к снижению биологической активности не только витамин-В12-зависимых белков, но и нарушениям экспрессии многочисленных фолат-зависимых витаминозависимых генов.

Анализ реактомных ролей В12-зависимых белков подтвердил сделанные выше выводы и, также, указал на возможный антибактериальный эффект витамина В12 (синтез антимикробного пептида альфа-дефенсина, рис. 6).

Дефицит активности витамин-В12-зависимых белков, особенно во внутриутробном периоде, приводит к весьма драматическим последствиям. С нарушениями активации В12-зависимых белков протеома человека ассоциирован целый спектр врождённых заболеваний. Так, дефицит активности В12-зависимых белков связан, в частности, с аномалиями развития (F78 Другие нарушения развития интеллекта, Q21 Врождённые аномалии перегородок сердца, G60 Наследственная и идиопатическая невропатия) и такими патологиями, как E72 Другие нарушения аминокислотного обмена, E71 Болезнь «кленового сиропа мочи», метаболическими нарушениями (ацидемия, ацидурия, гомоцистинурия, избыток метилмалоновой кислоты), I42 Кардиомиопатия, K86 Другие болезни поджелудочной железы, E80 Нарушения порфиринового и билирубинового метаболизма, D51 Витамин B12-дефицитная анемия (рис. 7).

Анализ молекулярных механизмов синергидного действия витаминов B1, В6, В12

В неврологии традиционно используются витамины группы В, особенно в комбинации «витамины В1, В6 и В12». Такая комбинация возникла не случайно, а основана на долговременной клинической практике лечения полинейропатии. Проведённый в настоящей работе анализ синергидных биологических ролей В1, В6, В 12-зависимых белков в номенклатуре Gene Ontology (GO) показал, что «тройственный синергизм» В1 + В6 + В12 необходим, прежде всего, для поддержания функции различных компартментов клетки (митохондрий, клеточных мембран, пероксисом, ядра клетки) и синтеза АТФ. Парный синергизм В: + В6 необходим для катаболизма аминокислот, глюкозы, жирных кислот, синтеза белка на рибосоме и синтеза миелиновой оболочки нейронов (табл. 5).

Реактомный анализ показал, что синергидное сочетание витаминов В1 и В6 необходимо для метаболизма аминокислот и углеводов, а синергидное сочетание В6 + В12 — для биосинтеза гема и метаболизма липидов (табл. 6).

Анализ заболеваний, ассоциированных с дефицитами активности В1, В6, В12-зависимых белков показал, что «тройственный синергизм» необходим для профилактики анемии (в т. ч. мегалобластной), врождённых аномалий развития, нарушений метаболизма аминокислот, нарушений обмена фолатов и гомоцистеина (табл. 7). Синергидное сочетание «В1 + В12» профилактирует расстройства метаболизма аминокислот с разветвлённой цепью и липидов (диагнозы группы E71); синергидное сочетание «В1 + В6» важно для профилактики дистрофии мышц, энцефалопатии, E74 Других нарушений углеводного обмена. Синергидное сочетание «В6 + В12» важно для профилактики наследственной и идиопатической невропатии (G60), нарушений метаболизма порфирина и билирубина (E80) и нарушений эритропоэза, приводящих к анемии. 

Наиболее известным и крайне важным направлением тройственного синергидного действия витаминов В1, В6, В12 является регуляция процессов воспаления, осуществляемая, в частности, посредством обезвреживания гомоцистеина. Обычно, повышенные уровни гомоцистеина связывают только с недостатком активных фолатов в пище. Однако повышенный гомоцистеин является и результатом дефицита других витаминов группы В (прежде всего, В6 и В12) [5]. В крупномасштабном исследовании 10 601 здоровых добровольцев (средний возраст 56 лет) были проанализированы эффекты всех известных витамеров B6, фолатов, кобаламина, рибофлавина на уровни общего гомоцистеина. Было установлено, что более высоким концентрациям пиридоксаль-5-фосфата крови соответствовали более низкие уровни гомоцистеина [6].

Весьма интересным результатом проведённого анализа является установление молекулярных механизмов тройственного синергидного действия витаминов В1, В6, В12 на поддержание миелиновой оболочки нейронов (код GO:0043209 по номенклатуре GO). Так, миелиновая и митохондриальные фракции нервов содержат значительные количества тиамина [7]. Активность тиамин-зависимых ферментов важна для поддержания нейронального синтеза АТФ и синтеза миелиновых оболочек [8].

В частности, тиамин необходим для поддержания активности таких таргетных В1-зависимых ферментов как пируват дегидрогеназы митохондрий (субъединица Е1, ген PDHA1) и транскетолазы (ген TKT). У пациентов с митохондриальной энцефаломиелопатией отмечено снижение активности пируват дегидрогеназы, причём стимуляция активности этого фермента приводила к уменьшению повреждения миелиновых оболочек (по данным МРТ) и улучшению неврологического состояния пациентов [9]. Сниженная активность транскетолазы нарушает метаболизм аксонов и миелин-синтезирующих клеток ЦНС [10].

Витамин В6 и синтезируемый на его основе кофактор пиридоксаль-5-фосфат (ПЛФ) взаимосвязаны с биологическими активностями таких белков, как альбумин (ген PRO1341), и ферментами аспартат аминотрансфераза (ген GOT2) и глутамин синтетаза (ген GLUL). Альбумин сыворотки крови является белком-транспортёром кофактора ПЛФ и является существенным компонентом белковой фракции миелина [11]. Витамин В6 тормозит гликирование альбумина и, кроме того, необходим для регуляции экспрессии гена альбумина [12].

ПЛФ -зависимый фермент митохондриальная аспартат аминотрансфераза катализирует трансаминирование кинуренина (метаболит L-триптофана) с образованием кинуреновой кислоты. Фермент также усиливает всасывание длинноцепочечных жирных кислот, что принципиально необходимо для синтеза миелиновой оболочки [13].

Низкая обеспеченность организма витаминами В6 и В12 приводит к нарушениям метилирования ДНК, что снижает экспрессию гена глутамин синтетазы [14]. Сниженные уровни и активность фермента приводят к падению уровней нейротрофического фактора мозга и увеличивает апоптоз клеток, миелинизирующих аксоны в ЦНС [15]. При моделировании экспериментального аллергического энцефаломиелита обнаружен повышенный оксидантный стресс в сочетании со сниженной активностью фермента глутамин синтетазы [16].

Заключение

В неврологической практике комбинация витаминов В1, В6 и В12 используется для лечения демиелинизирующих заболеваний уже более 40 лет. В течение последних 20 лет данное сочетание витаминов используется для обезвреживания гомоцистеина. Однако, как показывают результаты настоящего исследования, синергизм витаминов В1, В6 и В12 не ограничивается только лечением демиелинизирующих заболеваний и гипергомоцистеинемии.

Так, «тройственный синергизм» необходим для профилактики анемии (в т. ч. мегалобластной), врождённых аномалий развития, нарушений метаболизма аминокислот и фолатов. Парное синергидное сочетание «В1 + В12» профилактирует расстройства метаболизма аминокислот с разветвлённой цепью и липидов (диагнозы группы E71). Синергидное сочетание «В1+ В6» важно для профилактики дистрофии мышц, энцефалопатии, нарушений углеводного обмена. Синергидное сочетание «В6 + В12» важно для профилактики наследственной и идиопатической невропатии (G60), нарушений метаболизма порфирина и билирубина (E80) и нарушений эритропоэза, приводящих к анемии.

Таким образом, результаты протеомного анализа позволяют утверждать, что препараты, в которые входят все три витамина, будут обладать существенно большим клиническим потенциалом, чем парные сочетания витаминов и, тем более, моноформы витаминов. Следует отметить, что, вопреки широко распространяемому заблуждению о том, что витамин В12 якобы «вызывает рак», сочетание фолатов с витамином В12 улучшают выживание пациентов с опухолями, проходящих курс химиотерапии антифолатным препаратом пеметрекседом [17]. Такие производные витамина В12, как нитрозилкобаламин [18] и метилкобаламин [19], вообще проявляют выраженные противоопухолевые эффекты, инициируют апоптоз раковых клеток (тем самым тормозя рост опухолей) и повышают выживаемость.

Синергидное сочетание витаминов В1, В6 и В12 представлено в препарате «Нейробион» (тиамина дисульфид — 100 мг, пиридоксина гидрохлорид — 200 мг, цианокобаламина — 200 мкг) показало свою эффективность при лечении люмбаго с ишиасом (M54.4), межреберной невропатии (G58.0), поражений лицевого нерва (G51), невралгии тройничного нерва (G50.0) и др. В соответствии с результатами настоящего исследования спектр клинических применений Нейробиона значительно шире и включает, по меньшей мере, терапию мегалобластной анемии, идиопатической невропатии и энцефалопатий, связанных с нарушениями метаболизма аминокислот (что типично, например, для алкогольной энцефалопатии).