Поиск взаимосвязи между анксиолитическим действием оригинального производного пирроло [1,2-A] пиразина, лиганда TSPO - ГМЛ-1 и его концентрациями в плазме крови крыс

Введение

Создание лекарственных средств, относящихся к лигандам митохондриального транслокаторного белка (Translocatorprotein; TSPO), обладающих анксиолитической активностью, нетоксичных и без побочных эффектов – одна из актуальных проблем современной психофармакологии.

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» на основе фармакофорной модели строения лигандов TSPO и метода молекулярного докинга была создана группа гетероциклических лигандов TSPOряда 1-фенилпирроло[1, 2-a]пиразин-3-карбоксамидов [1]. По результатам исследований invitro и invivo, в качестве наиболее перспективного анксиолитического средства было отобрано вещество, представляющее собой N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло [1, 2-a] пиразин-3-карбоксамид (рабочий шифр ГМЛ-1) [2, 3].

На грызунах в тестах «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) и «открытое поле со световой вспышкой» (в модификации Бородина П.М.) показано, что ГМЛ-1 в интервале доз 0,1–10,0 мг/кг обладает анксиолитической активностью (внутрибрюшинное, пероральное введение), выраженность эффекта ГМЛ-1 соответствовала диазепаму в дозе 1 мг/кг. При этом ГМЛ-1 обладает низкой острой токсичностью после внутрибрюшинного введения (LD50 > 1000 мг/кг) [2, 3].

Полученные данные указывают на высокий потенциал ГМЛ-1 как анксиолитика.

Необходимым этапом разработки оригинального лекарственного средства является изучение его доклинической фармакокинетики (ФК). Фармакокинетические данные необходимы для установления зависимости «концентрация – эффект», которая характеризуется меньшими видовыми различиями, чем зависимость «доза – эффект» и поэтому может быть использована для прогнозирования действия фармакологического средства у человека [4].

Исходя из вышеизложенного, цель данного исследования заключалась в сопоставлении продолжительности анксиолитического эффекта ГМЛ-1 в тесте ПКЛ с концентрациями потенциального анкисолитика в плазме крови крыс после его введения внутрь.

Материалы и методы

На рис. 1 представлена структурная формула изучаемого соединения. Молекулярная масса ГМЛ-1 – 341,4 г/моль. Фармацевтическая субстанция синтезирована в отделе химии лекарственных средств ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» и представляет собой гомогенный порошок жёлто-зелёного цвета, без запаха. Субстанция мало растворима в воде, легко растворима в этиловом спирте, очень легко растворима в хлороформе и диметилсульфоксиде.

Животные получены из питомника «Пущино» при филиале «Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» и содержались в условиях лабораторного вивария в контролируемых условиях окружающей среды. Изучение ФК и продолжительности анксиолитического действия ГМЛ-1 после его введения внутрь проводили на аутбредных крысах-самцах Wistar (220 ± 20 г) в тесте ПКЛ [5]. Исследуемое вещество вводили однократно внутрижелудочно в виде водной суспензии с твин 80 в дозе 1,0 мг/кг, животным контрольных групп вводили воду дистиллированную.

Поведение животных в тесте ПКЛ в течение 5 мин фиксировали через 1, 2, 3, 4, 5 и 6 ч после введения ГМЛ-1. В частности, оценивали пребывание (в %) животных в открытых рукавах по отношению к суммарному времени в открытых и закрытых рукавах лабиринта и число заходов (в %) в открытые рукава по отношению к суммарному числу заходов в открытые и закрытые рукава лабиринта. На каждый временной интервал использовали по 8 животных опытных и контрольных групп.

Для изучения ФК исследуемого вещества пробы крови отбирали в течение 12 ч: 0,0 (контроль), 15 и 30 мин, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 и 12 ч. На каждый момент времени использовали по 6 животных.

Все манипуляции с экспериментальными животными выполнены в соответствии с нормативной документацией, касающейся гуманного обращения с животными, и стандартными операционными процедурами (СОП) лабораторий фармакологической генетики и фармакокинетики ФГБНУ « НИИ фармакологии имени В.В. Закусова». Проведение экспериментов с животными одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Полученные путём декапитации животных образцы крови центрифугировали (3000 об/мин в течение 10 мин) с целью получения плазмы.

Для количественного определения ГМЛ-1 в плазме крови животных использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию с масс-спектрометрическим детектированием [6].

Статистическую обработку полученных в тесте ПКЛ результатов проводили, используя однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA, критерий Краскела-Уоллиса) и непараметрический анализ для независимых переменных (U-критерий Манна-Уитни). Данные результатов экспериментов представлены в таблице в виде M ± SD, где M – среднее арифметическое; SD – стандартное отклонение. Для оценки степени взаимосвязи показателей анксиолитического эффекта с концентрациями ГМЛ-1 в плазме крови использовали выборочный коэффициент корреляции Пирсона (r) [7].

Оценку значимости рассчитанных выборочных коэффициентов корреляции по величине статистики tr, вычисляли по формуле:

Результаты и обсуждение

Оценка продолжительности анксиолитического эффекта ГМЛ-1 у крыс в тесте ПКЛ

Анализ поведения крыс в тесте ПКЛ после внутрижелудочного введения ГМЛ-1 в дозе 1,0 мг/кг показал наличие выраженного анксиолитического эффекта у животных в течение первых пяти часов. Достоверно значимо увеличилось время пребывания и количество заходов в открытые рукава, сократилось время пребывания в закрытых рукавах лабиринта, значительно выросли интегральные показатели поведения животных в ПКЛ, такие как процент пребывания в открытых рукавах по отношению к суммарному времени в открытых и закрытых рукавах (                ) и процент заходов в открытые рукава по отношению к числу заходов в открытые и закрытые рукава ), по сравнению с контрольными группами (табл. 1). Изменение интенсивности анксиолитического эффекта исследуемого вещества у крыс на протяжении 6 ч наблюдения представлены на рис. 2 А, Б. Из рис. 2 А, Б видно, что максимальный эффект регистрировался через 2 ч после введения ГМЛ-1, затем выраженность эффекта падала и к 6 ч устанавливалась на уровне контрольных групп. Так, для показателя достоверность различий между контрольными и 6-часовыми значениями была статистически незначимой, из чего следует, что анксиолитический эффект исследуемого вещества регистрировался в течение 5 ч. Для другого интегрального параметра   достоверность различий между контрольными и 6-часовыми значениями была статистически значимой.

Таким образом, на основании анализа результатов эксперимента установлено, что анксиолитическое действие ГМЛ-1 в дозе 1,0 мг/кг продолжается в первые 5 ч после введения.

ФК ГМЛ-1 у крыс

Усреднённые концентрации ГМЛ-1 в плазме крови крыс после однократного введения исследуемого вещества внутрь в дозе 1,0 мг/кг представлены в табл. 2 и на рис. 2. Из рис. 2 видно, что ГМЛ-1 относительно быстро всасывается из ЖКТ в системный кровоток крыс (время достижения максимальной концентрации составило 1 ч). После достижения максимума концентрация анксиолитика линейно снижалась.

Сопоставление фармакодинамических показателей и концентраций ГМЛ-1 в плазме крови

С целью выявления возможных корреляционных зависимостей (степени выраженности связи) проведено сопоставление фармакодинамических показателей и концентраций ГМЛ-1 в плазме крови крыс после его однократного введения внутрь. Учитывая, что анксиолитический эффект ГМЛ-1 регистрировался в течение 5–6 ч после введения вещества, для выявления возможных корреляций с его концентрациями в плазме крови крыс использовали те же временные интервалы.

Установлено, что между концентрациями ГМЛ-1 в плазме крови крыс и его анксиолитическим эффектом существуют причинно-следственные связи (корреляционные зависимости) (табл. 2). Так, при сопоставлении пребывания животных в открытых рукавах по отношению к суммарному времени в открытых и закрытых рукавах лабиринта с концентрациями анксиолитика в течение 5 ч эксперимента выборочный коэффициент корреляции (r5) составил 0,786. Для интегрального параметра            значение r5 равнялось 0,763. Выборочный коэффициент корреляции для временного интервала 6 ч (r6) для параметров, характеризующих анксиолитический эффект, и концентраций ГМЛ-1 составил 0,342 и 0,709, соответственно. Далее была проведена оценка значимости рассчитанных выборочных коэффициентов корреляции по величине статистики tr. Установлено, что полученные значения r являются статистически недостоверными для данных объёмов выборок (n = 5 и n = 6, соответственно). Для многих лекарственных препаратов зависимость эффекта от концентрации хорошо описывается сигмоидной функцией (моделью Хилла) [9] или так называемой моделью Emax. Эта модель имеет три параметра: максимально возможный уровень эффекта (Emax), концентрация, при которой достигается 50 % максимального эффекта (EC50), параметр формы зависимости (γ), который для многих препаратов принимается равным 1 (гиперболическая функция). Зависимость эффекта от концентрации (С) в рамках такой модели описывается следующим уравнением: . Однакоимеющиеся данные не позволили успешно её применить. Возможно, для адекватной аппроксимации требуется больше исходных данных. Несмотря на то, что E -модель можно считать базовой моделью фармакодинамики, тем не менее, когда наблюдаемый эффект не превышает 50 % от максимального значения, или значение параметра E не может быть предсказано, зависимость «концентрация –эффект» можно аппроксимировать линейной моделью:

E=E0+S+C(t)

где:

C(t) – концентрация лекарственного вещества; S – параметр эффекта;

E0 – значение показателя эффекта без введения исследуемого вещества (обычно контроль) [8].

Последнее соотношение означает, что интенсивность фармакологического эффекта линейно зависит от уровня лекарственного вещества в плазме /сыворотке крови на низких концентрациях. На основе данной модели можно прогнозировать отсутствие эффекта при нулевых значениях концентрации, однако невозможно предсказать максимальный эффект. Более того, линеаризация допустима, если исследуемое вещество обратимо связывается с рецепторами, что в результате приводит к прямому фармакологическому эффекту. Использование линейной модели также не позволило адекватно описать имеющиеся в нашем распоряжении ряды данных.

Таким образом, между параметрами, характеризующими анксиолитический эффект, и концентрациями ГМЛ-1 в плазме крови крыс отсутствуют достоверно значимые причинно-следственные связи. Следует ещё раз отметить, что между максимальными значениями концентрации ГМЛ-1 в плазме крови и фармакологическим эффектом имеется временной сдвиг, т. е. максимальный эффект наступает на 1 ч позже максимальной концентрации. Однако, начиная с 2 ч и до 5 ч после введения ГМЛ-1 включительно, отмечается линейное снижение изучаемых характеристик. Таким образом, при увеличении объёма выборки и более частом отборе проб и одновременной регистрацией эффекта, эти связи могут быть выявлены.

С другой стороны, по мере снижения концентрации ГМЛ-1 в плазме крови наступает момент, когда создавшийся уровень изучаемого соединения не вызывает анксиолитического эффекта. По-видимому, для проявления анксиолитического эффекта требуются концентрации ГМЛ-1 в плазме крови крыс выше 2,9 нг/мл.

Выводы

1. Анксиолитическое действие ГМЛ-1 в дозе 1,0 мг/кг в тесте ПКЛ продолжается в первые 5 ч после однократного внутрижелудочного введения.

2. Величина анксиолитического эффекта ГМЛ-1 у крыс после введения внутрь не коррелирует с концентрацией анксиолитика в плазме крови.