Разработка и валидация методики количественного определения сукцината в плазме крови крыс методом ВЭЖХ-МС/МС

Актуальность. Сукцинат (янтарная кислота) — центральный метаболит цикла Кребса, через специфический сукцинатный рецептор SUCNR1 регулирующий многочисленные процессы. В ряде фармакологических препаратов сукцинат является важным компонентом, но его фармакокинетика при их введении остаётся малоизученной. Для выполнения данных исследований необходима чувствительная аналитическая методика.
Цель. Разработка и валидация методики количественного определения сукцината в плазме крови крыс.
Методы. Анализ выполняли на ВЭЖХ-МС/МС — Ultimate 3000 TSQ Fortis и колонке UCT Selectra C18 4,6 мм ×100 мм 3 мкм, 100 Å. Температура разделения — 35 °С, скорость потока — 0,5 мл/мин. Использовали градиентный режим элюирования смесью 0,1 % водного раствора муравьиной кислоты и 0,1 % раствора муравьиной кислоты в метаноле. Объём пробы — 5 мкл. Для пробоподготовки использовали метанол с добавлением в качестве внутреннего стандарта хлорамфеникола в концентрации 10 нг/мл. При валидации использовалась модельная матрица. Для детектирования сукцината использовали следующие переходы масс в негативном режиме ионизации: 117 m/z → 98,7 m/z, 117 m/z → 73,1 m/z.
Результаты. Методика характеризовалась селективностью, чувствительностью, правильностью, прецизионностью и линейностью в диапазоне концентраций 200−20000 нг/мл (1,69–169 мкМ). Отсутствовал перенос пробы, матричный эффект. Степень извлечения превышала 96 %. Сукцинат был стабильным при использованных условиях хранения.
Заключение. Разработана и валидирована методика количественного определения сукцината в плазме крови крыс, которая может быть использована для анализа концентрации эндогенного сукцината и фармакокинетики сукцината после введения сукцинат-содержащих лекарственных препаратов.

1. de Castro Fonseca M, Aguiar CJ, da Rocha Franco JA, et al. GPR91: expanding the frontiers of Krebs cycle intermediates. Cell Commun Signal. 2016 Jan 12;14:3. doi: 10.1186/s12964-016-0126-1.

2. Tretter L, Patocs A, Chinopoulos C. Succinate, an intermediate in metabolism, signal transduction, ROS, hypoxia, and tumorigenesis. Biochim Biophys Acta. 2016 Aug;1857(8):1086-1101. doi: 10.1016/j.bbabio.2016.03.012.

3. Калинин Р.Е., Сучков И.А., Райцев С.Н. и др. Роль фактора, индуцируемого гипоксией, 1α при адаптации к гипоксии в патогенезе новой коронавирусной болезни 2019. Российский медико-биологический вестник имени академика И. П. Павлова. 2024;32(1):133-144. [ doi: 10.17816/PAVLOVJ165536.

4. He W, Miao FJ, Lin DC, et al. Citric acid cycle intermediates as ligands for orphan G-protein-coupled receptors. Nature. 2004 May 13;429(6988): 188-93. doi: 10.1038/nature02488.

5. Gilissen J, Jouret F, Pirotte B, Hanson J. Insight into SUCNR1 (GPR91) structure and function. Pharmacol Ther. 2016 Mar;159:56-65. doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.01.008.

6. Оковитый С.В., Радько С.В., Шустов Е.Б. Сукцинатные рецепторы (SUCNR1) как перспективная мишень фармакотерапии. Химико-фармацевтический журнал. 2015; 49(9):3-7. doi: 10.30906/0023-1134-2015-49-9-3-7.

7. Lamy C, Mansard C, Blondel L, et al. Quantification of succinic acid levels, linked to succinate dehydrogenase (SDH) dysfunctions, by an automated and fully validated liquid chromatography tandem mass spectrometry method suitable for multi-matrix applications. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2022 Jan 15;1189:123085. doi: 10.1016/j.jchromb.2021.123085.

8. Bao X, Wu J, Shuch B, et al. Quantitative Profiling of Oncometabolites in Frozen and Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Specimens by Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Sci Rep. 2019 Aug 2;9(1):11238. doi: 10.1038/s41598-019-47669-5.

9. Jung Y, Song JS, Ahn S. Pharmacokinetics and Tissue Distribution of 13C-Labeled Succinic Acid in Mice. Nutrients. 2022 Nov 10;14(22):4757. doi: 10.3390/nu14224757.

10. Xu L, Zha A, Xiong X, Sun D. Determination of succinic acid and lactic acid in pigs' serum, intestinal contents, and meat by ultrahighperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2024 Aug 15;38(15):e9769. doi: 10.1002/rcm.9769.

11. Shi Y, Tse S, Rago B, et al. Quantification of fumarate and investigation of endogenous and exogenous fumarate stability in rat plasma by LC-MS/MS. Bioanalysis. 2016 Apr;8(7):661-75. doi: 10.4155/bio-2015-0026.

12. Monostori P, Klinke G, Richter S, et al. Simultaneous determination of 3-hydroxypropionic acid, methylmalonic acid and methylcitric acid in dried blood spots: Second-tier LC-MS/MS assay for newborn screening of propionic acidemia, methylmalonic acidemias and combined remethylation disorders. PLoS One. 2017 Sep 15;12(9):e0184897. doi: 10.1371/journal.pone.0184897.

13. Sadagopan N, Li W, Roberds SL, et al. Circulating succinate is elevated in rodent models of hypertension and metabolic disease. Am J Hypertens. 2007 Nov;20(11):1209-15. doi: 10.1016/j.amjhyper.2007.05.010.

14. Kushnir MM, Komaromy-Hiller G, Shushan B, et al. Analysis of dicarboxylic acids by tandem mass spectrometry. High-throughput quantitative measurement of methylmalonic acid in serum, plasma, and urine. Clin Chem. 2001 Nov;47(11):1993-2002.