Сравнительное фармакокинетическое исследование биоэквивалентности двух пролонгированных лекарственных форм метопролола

Большое количество выпускаемых различными фирмами воспроизводимых лекарственных препаратов совсем не означает одинакового фармакологического и терапевтического действия этих лекарств. Для того чтобы ориентироваться в правильном назначении того или иного препарата, врачу необходимо знать, чем отличаются воспроизводимые лекарства (иными словами – знать отличия фармакокинетических параметров этих препаратов). На основании этих знаний врач может грамотно назначать дозировку лекарства и подбирать оптимальные интервалы дозирования. Во всем мире для подтверждения одинаковой терапевтической активности воспроизводимых препаратов проводятся исследования биоэквивалентности. При этом в качестве основного критерия выбирается одинаковая биодоступность сравниваемых лекарственных средств, определяемая сравнением площадейпод кривыми в координатах «концентрация-время» - AUC. Кроме этого критерия в последнее время используется и ряд других сравниваемых фармакокинетических параметров: MRT (среднее время удержания), Cmax (максимальная концентрация), Tmax (время достижения максимальной концентрации) и некоторые другие параметры. Большое значение имеет вариабельность получаемых данных.

Дело в том, что при одинаковых значениях площадей (AUC) совсем необязательно, что исследуемый препарат будет одинаково всасываться и выводиться из организма также как и препарат, выбранный в качестве стандарта.

Целью настоящего исследования было исследовать биоэквивалентность двух препаратов пролонгированного действия, содержащих метопролол в одинаковых количествах – 50 мг, на основании полученных фармакокинетических данных - «БЕТАЛОК в30К» и «ЭМ3ОК».

Метопролол - белый кристаллический порошок. Хорошо растворим в воде, умеренно растворим в этаноле, слабо растворим в дихлорметане.

Кардиоселективный бета1-адреноблокатор без внутренней симпатомиметической активности. Оказывает гипотензивное, антиангинальное и антиаритмическое действие. Блокирует преимущественно бета1-адренорецепторы сердца, не обладает внутренней симпатомиметической и мембраностабилизирующей активностью. Уменьшает сердечный выброс и CАД, замедляет сердечный ритм, ослабляет стимулирующий эффект катехоламинов на миокард при физической нагрузке и умственном перенапряжении, предупреждает рефлекторную ортостатическую тахикардию. Антигипертензивное действие обусловлено уменьшением сердечного выброса и синтеза ренина, угнетением активности ренин%ангиотензиновой системы и ЦНС, восстановлением чувствительности барорецепторов и, в итоге, уменьшением периферических симпатических влияний. Гипотензивный эффект достигается быстро и продолжается в течение 6 часов. При применении метопролола сукцината – клинический эффект сохраняется 24 ч. Антиангинальный эффект является следствием уменьшения частоты и силы сердечных сокращений, энергетических затрат и потребности миокарда в кислороде. Антиаритмическое действие проявляется в устранении аритмогенных симпатических влияний на проводящую систему сердца, замедлении синусового ритма и скорости распространения возбуждения через АV узел. Понижает автоматизм синусового узла, уменьшает ЧСС, замедляет AV проводимость, снижает сократимость и возбудимость миокарда, уменьшает минутный объем сердца, снижает потребность миокарда в кислороде.

Фармакокинетика метопролола всесторонне представлена в работах [1-6]. При пероральном приеме обычных лекарственных форм метопролола в дозе 50 мг препарат быстро абсорбируется и достигает максимальной концентрации (Cmax) от 5 до 22 нг/мл, а время ее достижения (Tmax) находится между 2,5 и 14 ч после приема. Т1/2 колеблется от 3 до 7 часов. Биодоступность метопролола тартрата составляет около 50% при первом приеме и возрастает до 70% при повторном применении. Метаболизируется в печени с получением двух активных метаболитов. При пероральном приеме менее 5% принятой дозы выводится с мочой в неизмененном виде. Быстро распределяется в тканях, проникает через гематоэнцефалический и плацентарные барьеры, обнаруживается в грудном молоке в более высокой концентрации, чем в плазме. При нарушении функции почек биодоступность препарата не изменяется, но может снижаться скорость экскреции метаболитов.

В данном исследовании определяли относительную биодоступностьдвух препаратов метопролола пролонгированного действия, представленных на рынке России, при однократном пероральном приеме 50 мг препарата. Тестируемым препаратом (Test) являлся генерический препарат «ЭМ3ОК», содержащий метопролол тартрат , а в качестве препарата сравнения использовали оригинальный препарат «БЕТАЛОК в30К» (Standard), содержащий метопролол сукцинат. Оба препарата применялись в дозе 50 мг. Изученные данные in vitro говорили о примерно одинаковых фармацевтических характеристиках этих препаратов. Но поскольку данные, полученные in vitro, не всегда являются прогностически достоверными в отношении действия препарата in vivo, было интересно провести исследование биоэквивалентности на здоровых добровольцах для оценки взаимозаменяемости оригинального и генерического препарата. В настоящей работе представлены экспериментальные данные, полученные в результате проведенного исследования.

Участники
В работу были включены 18 здоровых добровольцев, разбитых на 2 группы (группа А и группа Б). Группы были рандомизированы по полу, возрасту, массе тела. Демографические и некоторые другие данные представлены в табл.1 и 2.

После того как врач-исследователь проинформировал участников о целях, ходе и возможном риске проведения данного исследования, все добровольцы подписали информированное согласие на участие в исследовании. Они были подобраны на основании данных анамнеза, физикального обследования, в ходе которого было установлено отсутствие видимой патологии печени, почек, сердца, ЖКТ и крови или каких-либо острых или хронических заболеваний.

Всесторонний лабораторный скрининг проводили в течение 7 дней до начала исследования в целях подтверждения удовлетворительного состояния участников. Другими критериями включения являлись отрицательные тесты на содержание наркотиков, алкоголя, ВИЧ и др. Исследование проводилось согласно требованиям, указанным в методических рекомендациях по проведению исследований по биоэквивалентности в Российской Федерации от 2002 г.

Исследуемые препараты
В качестве тестируемого препарата был выбран «ЭМ3ОК» (Галена, Чешская Республика) в таблетках по 50 мг (№ серии 3А1070403), а в качестве препарата сравнения избрали «БЕТАЛОК ЗОК» (Астра Зенека, Швеция) в таблетках по 50 мг (№ серии D13085).

Дизайн исследования
Исследование было рандомизированным двойным перекрестным, основанным на однократном приеме дозы препарата 18 здоровыми добровольцами. Как участники, так и исследователи могли знать, какой препарат получает тот или иной человек в каждый период, однако этой информацией не обладала аналитическая группа.

Каждый доброволец утром во время завтрака принимал 1 таблетку препарата (50 мг), которые запивал 200 мл кипяченой воды комнатной температуры. Группа А получала 1 таблетку (50 мг) препарата «БЕТАЛОК ЗОК», а группа Б - 1 таблетку (50 мг) препарата «ЭМЗОК». Через 7 дней (период отмывки) группа А получала 1 таблетку (50 мг) препарата «ЭМЗОК», а группа Б - 1 таблетку (50 мг) препарата «БЕТАЛОК ЗОК».

Пробы крови в количестве 5,0 мл получали из локтевой вены методом венопункции или из установленного в локтевой вене катетера. Пробы отбирали в стерильные, герметично закрывающиеся одноразовые пластиковые пробирки. Из крови готовили сыворотку обычным способом (инкубация при комнатной температуре 30-45 мин, центрифугирование при 5600 об/мин, 10 мин) и сразу замораживали полученную сыворотку при -18ºС. Анализ сыворотки на содержание в ней метопролола проводили не позже, чем на 2-е сутки. Пробы крови отбирали до и через 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0; 12,0; 24 и 48 часов после приема препарата по следующей схеме:

Группа «А» - до и через 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0; 12,0; 24 и 48 часов после приема препарата «БЕТАЛОК ЗОК» (1 таблетка - 50 мг);

Группа «Б» - до и через 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0; 12,0; 24 и 48 часов после приема препарата «ЭМЗОК» (1 таблетка - 50 мг).

После периода отмывки (7 дней) группа «А» принимала по той же схеме препарат «ЭМЗОК», а группа «Б» - препарат «БЕТАЛОК ЗОК».

Аналитический метод
Из многочисленных описанных в литературе методов определения метопролола в сыворотке крови в основном применяются методы, основанные на применении обратнофазной ВЭЖХ [7-10].

В основном, эти методы основаны на применении ВЭЖХ с ультрафиолетовым или флюоресцентным детектированием. При этом применяется однократная или многократная экстракция препарата из сыворотки крови органическим растворителем с последующим упариванием в токе инертного газа или воздуха при низкой температуре (30%50ºС), растворением сухого остатка в ограниченном объеме растворителя (в большинстве случаев % элюента) и анализом полученного раствора на обратнофазной хроматографической колонке. Метод с использованием осаждения белков крови с последующим анализом надосадочной жидкости с помощью ВЭЖХ в случае определения препаратов этой группы не применим из%за низкой чувствительности метода и большого количества эндогенных веществ, мешающих определению. Кроме того, риск загрязнения хроматографической колонки недоосажденными белками крови из супернатанта при данном способе определения существенно возрастает.

Нами был использован модифицированный метод определения, описанный в работе [8]. Модификация состояла в том, что была предложена новая подвижная фаза, а хроматографическое разделение проводили на микроколонке Диасфер-100-С18, 6 мкм. Препарат извлекали из сыворотки крови экстракцией хлористым метиленом или хлороформом после подщелачивания пробы сыворотки разбавленным раствором едкого натра (коэффициент экстракции 98±1,5%).

К образцу сыворотки крови объемом 0,5 мл (здесь и далее – точные объемы) добавляли 100 мкл 0,1 н раствора едкого натра и 3,0 мл хлороформа. Смесь подвергалась энергичному встряхиванию на вибромиксере 2 мин, центрифугированию в течение 10 мин при 5600 об/мин. Затем 2,7 мл нижнего органического слоя отбирали автоматической пипеткой и упаривали экстракт в токе азота при 40ºС. Сухой остаток растворяли в 120 мкл подвижной фазы и 50 мкл полученного раствора вводили в хроматографическую систему. Хроматографическое разделение проводили при комнатной температуре (20±2ºС) на микроколонке Диасфер-100%С18, зернением 6 мкм и размерами 2*150 мм (сорбент разработан и упакован ЗАО «БиоХимМак СТ»). В качестве детектора использовали проточный спектрофлюориметр «Shimadzu» – 551 (Япония), детектирование проводили при длинах волн (lem=222 и lex=305 нм). В качестве подвижной фазы использовали смесь 87,7% ацетонитрила, 12,2% воды и 0,031% конц. ортофосфорной кислоты. Объемная скорость элюирования составляла 0,4 мл/мин. Концентрацию препарата рассчитывали по методу абсолютной калибровки.

Калибровочные операции проводили следующим образом: к 0,5 мл интактной сыворотки крови, полученной обычным способом добавляли известное количество препарата (стандартный раствор в метиловом спирте) для получения растворов с концентрацией 3, 10, 15, 40 и 90 нг/мл сыворотки (5 растворов). Полученные калибровочные растворы обрабатывали и анализировали описанным выше способом. Калибровочный график в изученном интервале концентраций представлял собой прямую линию (Kкорр.= 0,987) описываемую уравнением С = 0,143* h, где С - концентрация метопролола в сыворотке крови (в нг/мл), h - высота хроматографического пика (в мм).

Каждая проба крови анализировалась не менее двух раз.

Калибровочные кривые строили по результатам хроматографического анализа на основе измерений высот хроматографических пиков. Результаты анализа контрольных образцов вносили в таблицу, рассчитывали средние значения, стандартные ошибки и затем строили калибровочный график.

Измеренные значения концентраций на графике были линейны во всем исследованном диапазоне (0-100 нг/мл) и график представлял прямую линию.

Контрольные образцы для получения калибровочных графиков приготовляли трижды с интервалом в одну неделю. Образцы сыворотки крови, содержащие известное количество метопролола и находившиеся в морозильной камере при -18ºС в течении двух недель подвергали регулярному контрольному хроматографическому анализу каждые два дня. Установлено, что количество метопролола оставалось стабильным в течении всего периода наблюдения.

Порог чувствительности метода (абсолютная чувствительность по метопрололу в анализируемой пробе) составляла не ниже 0,5 нг метопролола в мл сыворотки крови. Относительная ошибка определения составила 8,79% при концентрации препарата 15 нг/мл.

Фармакокинетические расчеты
Основные фармакокинетические параметры метопролола, полученные в результате исследования двух препаратов приведены в табл 3. AUC для метопролола (представляет собой площадь под кривой «концентрация – время») были вычислены в соответствии с правилом трапеции с помощью специализированных компьютерных программ.

В добавление к этому для метопролола определяли соотношение Cmax/AUC и VRT (дисперсия среднего резидентного времени). AUC, Cmax, MRT и Cmax/AUC сравнивали методом вариационного анализа АNOVА. Были подсчитаны 90% доверительные интервалы. Все тесты и сравнения оценивали при уровне достоверности 95% (р?0,05).

Результаты и их обсуждение
AUC для метопролола может быть продлена до бесконечности с достаточной надежностью для всех случаев и таким образом ее можно сравнивать для двух препаратов у всех 18 добровольцев.

Для оценки биоэквивалентности препаратов «ЭМЗОК» (test) и «БЕТАЛОК ЗОК» (standard) был проведен статистический анализ полученных фармакокинетических данных. В качестве основных переменных при этом были выбраны показатели AUC (площадь под кривой), MRT, Cmax (максимальное значение), отношения Cmax/AUC соответствующих фармакокинетических кривых. Анализ проводился как для test , так и для standard.

На рис. 1 представлены графики изменения сывороточных концентраций метопролола во времени после однократного приема таблеток «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» (усредненные данные). Как видно из сравнения этих графиков, характер кривых зависимости содержания метопролола в крови после приема таблеток «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» отличается.

Препарат из исследуемых форм достаточно продолжительное время всасывается в организме. Времена достижения максимальной концентрации и сами значения максимальной концентрации довольно значительно различаются. Так, в случае применения препарата «ЭМЗОК», содержание его в крови достигает максимального значения (18,2 ± 2,99 нг/мл) к Tmax = 4,60 ± 1,24 час. В случае применения препарата «БЕТАЛОК ЗОК» эти величины составляют по нашим данным (Tmax = 8,1 ± 1,61 и Сmax= 10,4 ± 2,19 нг/мл*ч), затем концентрация метопролола в крови монотонно убывает и после 48 часов после приема таблеток «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» практически не определяется. Наблюдаемые различия в концентрациях метопролола в крови добровольцев после приема таблеток «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» могут быть так же объяснены межиндивидуальной вариабельностью и различием в составах наполнителей лекарственных форм.

Кинетика метопролола после приема таблеток исследуемых лекарственных форм «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» удовлетворительно описывается однокамерными моделями с внемодельным всасыванием.

Период времени наблюдения T был равен 48 часам. Для статистического оценивания были сделаны предположения о распределении основных параметров:
1)параметр AUC имеет log%нормальное распределение,
2)параметры MRT и VRT % нормальное.
Статистический анализ включал в себя следующие процедуры: вычисление базовой и порядковой статистики, дисперсионный анализ, анализ остатков, графические методы, вычисление доверительных интервалов, вычисление и анализ отношений биоэквивалентности и относительной степени всасывания лекарственного вещества, определяемой отношением соответствующих максимальных концентраций, проверка интервальных критериев, критерия знаковых рангов Уилкоксона, построение гистограммы распределения парных геометрических средних отношений биоэквивалентности.

Для отношений биоэквивалентности и отношений соответствующих максимальных концентраций a-priori были установлены допустимые границы 0.8 - 1.2. При этом средние значения отношений биоэквивалентности должны быть в пределах 0.9 - 1.1, а отношения максимальных концентраций в пределах 0.85 - 1.15. Кроме того, должны быть недостоверны различия между основными переменными и отношениями Cmax/AUC на уровне значимости не менее 95 %.

Средние значения lnAUC в пределах интервала 0 - 48 часов были оценены как 5,61 ± 0,2 для test и 5,49 ± 0,24 для standard . Относительная биодоступность 117 ± 40 % с 90% доверительным интервалом Стьюдента 1,0 – 1,26 и интервалом, построенным с помощью программы ANOVA, 1,0 – 1,26. Для индивидуальных отношений биодоступности по правилу 75/125 2 значения были меньше и 4 больше заданных пределов.

Cmax для test была 18,2 ± 2,99 нгмл и для standard - 10,4 ± 2,19 нгмл. Значение парного t-критерия для разности средних значений равно 10,2.

Tmax было 4,6 ± 1,24 часов для test и 8,1 ± 1,61 для standard. Значение парного t-критерия для разности средних значений равно -7,62.

Для MRT – средние значения были оценены как 15,65 ± 0,82 часов для test и для standard 20,05 ± 1,26 часов. Значение парного t-критерия для разности средних значений равно - 12,7.

Для VRT – средние значения были оценены как 116,7 ± 11,54 часов в квадрате и 140,0 ± 6,35 часов в квадрате, соответственно для test и standard.

Для параметров сравнения Cmax, Tmax, MRT, VRT, Cmax/AUC нулевая гипотеза о том, что генеральные средние для этих параметров равны между собой, была отвергнута на уровне значимости (p<0,01). Полученные с помощью метода ANOVA 90%-ный доверительные интервалы для разности средних значений этих параметров не содержат точку эквивалентности и существенно смещены.

При проверке равенства двух средних по этому критерию проверялось отношение биодоступности для переменной AUC при значениях границ r1=0,8 и r2=1,25. Для test и standard 2 индивидуальные отношения биодоступности меньше и 4 больше заданного интервала. Для отношений биодоступности были рассчитаны среднее значение и 90% доверительный интервал. Среднее значение равно 1,17 и выходит за допустимую для него правую границу 1,1; а 90% доверительный интервал Стьюдента 1,0 - 1,26 несимметричен относительно точки эквивалентности (1), но практически находится внутри установленных пределов [0,8; 1,25].

Точка эквивалентности является левой границей рассчитанного доверительного интервала для разности средних значений. Интервальный тест для отношений максимальных концентраций не выполняется: практически все индивидуальные значения (кроме 1) выходят за фиксированную верхнюю границу 1,25. Среднее значение 1,82 находится за пределами (0,85 – 1,15), а рассчитанные границы 90% интервала [1,6; 1,95] (или интервал ANOVA [1,6; 1,95]) выходят за заданные пределы 0,8 – 1,25 и не содержат точку эквивалентности. При использовании процедуры теста анализа индивидуальных различий рассматриваются не отдельно данные для сравниваемых препаратов, а столбец их разностей (сопоставление пар) в предположении об отсутствии влияния последовательности получения препаратов на полученные результаты, при этом перекрестный дизайн типа AB/BA ничем не отличается от обычного перекрестного дизайна. Величины разностей считаются реализациями нормальной случайной величины, которая имеет нулевое математическое ожидание и неизвестную дисперсию (при справедливости нулевой гипотезы). Проверку гипотезы проводили по парному t – критерию (см. рис.2.). Нулевую гипотезу об отсутствии различий на уровне значимости 5% не удалось отвергнуть только для параметра lnAUC. Различия для всех остальных параметров сравнения были признаны статистически значимыми (p<0,001). Критерий знаковых рангов Уилкоксона и построенная гистограмма (рис.3.) демонстрируют несимметричное распределение попарных геометрических средних вокруг точки эквивалентности. Практически все (кроме трех) значения попарных геометрических средних превышают значение 1,25, то есть располагаются правее допустимой верхней границы. Значение медианного элемента равно 1,78. Непараметрический доверительный интервал, полученный с помощью данного подхода, равен [1,54; 2,02].

Из полученных данных видно, что практически все параметры, характеризующие кинетику циркуляции метопролола, его распределение и элиминацию в организме (Сmaxl, tmax, MRT) при приеме изучаемых лекарственных форм кроме площади под фармакокинетической кривой (AUC) для «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» различны (См. табл.3). Основные параметры, характеризующие биодоступность сравниваемых лекарственных форм, отличаются, причем эти различия связаны с более высокими MRT метопролола в случае применения таблеток «БЕТАЛОК ЗОК». Так, для метопролола % величина среднего времени удержания (MRT) при приеме таблеток «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» - (20,05 ± 1,26 и 15,65 ± 0,82) ч, соответственно. Площади же под фармакокинетическими кривыми (AUC) для метопролола различаются незначительно (249,4 ± 53,9 и 277,6 ± 53,8, нг*мл/ч), соответственно, при приеме таблеток «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК». Исходя из отношения значений площадей под кривыми, можно рассчитать относительную биодоступность метопролола при приеме таблеток «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК», она составляет 1,17 ± 0,4.

Нами были проведены расчеты прогнозируемых минимальных и максимальных концентраций препаратов при различных схемах дозирования. Результаты этих расчетов представлены в таблицах 4 и 5.

Из представленных в таблицах данных видно, что для создания уровня метопролола, получаемого при применении 50 мг препарата «БЕТАЛОК ЗОК» (Cmin, = 7, 6 нг/мл, Cmax, = 15,3 нг/мл) один раз в сутки, препарат «ЭМЗОК» необходимо применять два раза в сутки по 25 мг. Представленные данные хорошо согласуются с полученными фармакокинетическими параметрами метопролола в исследовании биоэквивалентности изучаемых лекарств. Так t1/2составляли 4 и 8 час, а MRT – 17,6 и 25,8 ч для «ЭМЗОК» и «БЕТАЛОК ЗОК» соответственно.

Выводы

Полученные результаты не позволяют сделать вывод о совпадении основных фармакокинетических параметров метопролола и о биоэквивалентности исследуемых лекарственных форм. Препарат «БЕТАЛОКЗОК» обладает лучшими фармакокинетическими характеристиками, позволяющими более надежно достичь стационарного уровня концентрации метопролола (явно выраженное плато на фармакокинетической кривой), Препарат «ЭМЗОК» значительно быстрее всасывается из лекарственной формы, уровень максимальной концентрации метопролола в крови существенно выше, чем при применении препарата «БЕТАЛОК ЗОК» и соответственно быстрее выводится из организма, т.е. этот препарат более напоминает обычную лекарственную форму метопролола. Таким образом применять ЭМЗОК по схеме, применяемой при лечении препаратом «БЕТАЛОК ЗОК» (суточные дозы, разовые дозировки, режимы дозирования) не представляется возможным. «БЕТАЛОК ЗОК» назначают один раз в сутки, т.е. с интервалом 24 часа. Для того чтобы получить сравнимые уровни метопролола в крови и одинаковую эффективность при применении препарата «ЭМЗОК» его необходимо назначать по нашим расчетам два раза в сутки.