Preview

Фармакокинетика и Фармакодинамика

Расширенный поиск

Определение азитромицина в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием

Полный текст:

Аннотация

Разработан метод количественного определения азитромицина для ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Предел обнаружения препарата составляет 0,5 нг/мл. Метод был применен для изучения фармакокинетики и биоэквивалентности препарата Азитромицин (капсулы по 250 мг отечественного производства) в сравнении с препаратом Сумамед® (аналогичная лекарственная форма производства компании «Плива», Хорватия). Фармакокинетическое исследование проводилось открытым перекрестным рандомизированным методом. В исследование были включены 18 добровольцев. Были рассчитаны фармакокинетические параметры, необходимые для оценки биоэквивалентности изучаемого препарата. Статистический анализ параметров фармакокинетики показал биоэквивалентность препаратов Азитромицин и Сумамед.

Для цитирования:


Писарев В.В., Смирнова Л.Б., Москалева Н.Е., Зверков Ю.Б., Белолипецкая В.Г., Суханов Я.В. Определение азитромицина в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Клиническая фармакокинетика . 2004;(1):23-26.

Разработан метод количественного определения азитромицина для ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Предел обнаружения препарата составляет 0,5 нг/мл. Метод был применен для изучения фармакокинетики и биоэквивалентности препарата Азитромицин (капсулы по 250 мг) в сравнении с препаратом Сумамед® (аналогичная лекарственная форма производства компании Плива, Хорватия). Фармакокинетическое исследование проводилось открытым перекрестным рандомизированным методом. В исследование были включены 18 добровольцев. Были рассчитаны фармакокинетические параметры, необходимые для оценки биоэквивалентности изучаемого препарата. Статистический анализ параметров фармакокинетики показал биоэквивалентность препаратов Азитромицин и Сумамед.

Азитромицин (9-деоксо-9а-аза-9а-метил-9а-гомоэритромицин (А) в виде дигидрата) – антибиотик широкого спектра действия. Наличие в его химической структуре атома азота позволяет отнести этот препарат к новой подгруппе макролидных антибиотиков – азалидам. По сравнению с другими макролидами обладает наиболее выраженным бактерицидным эффектом, способностью проникать в ткани, жидкости и клетки организма, максимальной длительностью периода полувыведения.

 

Азитромицин устойчив в кислой среде, благодаря чему быстро всасывается в желудочно-кишечном тракте (время достижения максимальной концентрации 2-3 ч). Высокий уровень всасывания обеспечивается и липофильностью молекулы азитромицина. После приема внутрь 500 мг препарата биодоступность составляет 37%. Максимальная концентрация в сыворотке после приема этой дозы 0,4 мг/л, однако в тканях и клетках концентрация в 10-50 раз выше, а в очагах инфекции на 24-34% больше, чем в здоровых тканях и коррелирует со степенью воспалительного отека.

Элиминация азитромицина из сыворотки проходит в два этапа: Т½ составляет 14-20 ч между 8 и 24 ч после приема препарата и 41 ч в интервале от 24 до 72 ч, что позволяет принимать препарат 1 раз в сутки [1].

В литературе имеется несколько публикаций, посвященных количественному определению азитромицина в биологических жидкостях методом ВЭЖХ. Так, в работах [2, 3, 4] анализ проводили методом ВЭЖХ с электрохимическим детектором и чувствительностью обнаружения препарата в плазме крови 10 нг/мл. В докладе [5] описаны условия определения азитромицина методом ВЭЖХ с детектором по флюоресценции. Чувствительность в этом случае составила 98,8 нг/мл. Авторами работы [6] приведены результаты сравнения методов ВЭЖХ с масс-спекрометрическим (химическая ионизация при атмосферном давлении) и электрохимическим детектированием, использованных для количественного обнаружения препарата в плазме крови. В этом исследовании удовлетворительная точность и воспроизводимость результатов анализа наблюдалась в диапазоне концентраций 10 – 250 нг/мл и оба метода показали хорошую корреляцию между собой.

Материалы и методы. Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Agilent 1100» (США), оснащенным вакуумным дегазатором, градиентным насосом, автосамплером и термостатом колонок, а также масс- спектрометрическим детектором «Agilent 1100VL» (США) c ионизацией при атмосферном давлении в электроспрее (API-ES). При приготовлении пробы использовались вакуумный концентратор DNA mini (Австрия) и картриджи для твердофазной экстракции AccuBond II ODS-C18, 100 мг производства «Agilent» (США).

В работе использовали следующие реактивы: ацетонитрил 1-го сорта («Криохром», Санкт-Петербург), муравьиная кислота (Merck), ацетат аммония и ацетат натрия (Merck).

Хроматографическое разделение осуществляли на колонке Eсlipse SB-C18, 5 мкм, 4,6 х 150 мм (США) при температуре 70°С. Элюирование проводили в изократическом режиме. Состав подвижной фазы: ацетонитрил - 0,1 M ацетат аммония – 0,002 M ацетат натрия (60:20:20, об/об). Скорость потока 0,7 мл/мин.

В масс-спектре азитромицина полученном при ионизации вещества в электроспрее на приборе с одним квадрупольным анализатором наблюдался интенсивный пик с m/z 749,1 соответствующий протонированному молекулярному иону [М+H]+ и с m/z 771,5 - иону аддукта [М+Nа]+. Параметры работы детектора подбирались для достижения максимального выхода аддукта [М+Nа]+ : фрагментор 200, напряжение капилляра 4500 В, температура газа 3500С, скорость 12,0 л/мин, давление небулайзера 40 psig.

Для выделения азитромицина из плазмы крови и очистки экстракта использовался метод твердофазной экстракции. Картридж предварительно промывали последовательно 1 мл ацетонитрила и 2 мл 10% водного раствора ацетонитрила. К 1 мл плазмы добавляли 0,5 мл ацетонитрила, перемешивали на vortex 2 минуты, центрифугировали 5 минут при 13 000 об/мин. Супернатант переносили в картридж. Картридж промывали 1 мл 10% водного раствора ацетонитрила, затем элюировали азитромицин 4 мл смеси ацетонитрил – 0,01 М ацетат натрия – муравьиная кислота (90 : 10 : 0,1, об/об). Полученный элюат упаривали досуха под вакуумом при температуре 60˚С. Пробу растворяли в 200 мкл метанола и аликвоту 50 мкл переносили в хроматограф. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки с использованием программного обеспечения Chemstation фирмы «Agilent».

Разработанный метод был применен для изучения фармакокинетики и биоэквивалентности препарата АЗИТРОМИЦИН капсулы отечественного производства содержащие 250 мг азитромицина в сравнении с препаратом Сумамед®, фирма «Плива» (Хорватия). В исследование были включены 18 добровольцев. Фармакокинетическое исследование проводили открытым перекрестным рандомизированным методом в 2 этапа с интервалом между приемами препаратов 14 дней. Образцы крови в количестве 4 мл отбирали из кубитальной вены через 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 5; 8; 12; 24; 48 и 60 часов после приема препарата. Анализ фармакокинетических данных и оценка биоэквивалентности исследуемых препаратов проведены в соответствии с методическими рекомендациями по проведению качественных клинических исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов [7].

Фармакокинетические параметры рассчитывали с помощью программы «ESTRIP» модельно-независимым методом. Были рассчитаны следующие параметры: максимальная концентрация Cmax препаратов в крови (максимальное измеренное значение); время достижения максимальной концентрации Tmax; площадь под фармакокинетической кривой AUCo-t; площадь под фармакокинетической кривой AUCo-¥; период полувыведения T1/2; среднее время удержания препаратов в системном кровотоке MRT; относительная скорость всасывания Cmax/AUCo-t. Для оценки исследуемого препарата рассчитывали f¢ - относительную биодоступность исследуемой лекарственной формы азитромицина по отношению к сравниваемой, определяемую отношением AUCo-t,T/AUC0-t,R и f¢¢ - относительную степень всасывания азитромицина, определяемая отношением Cmax,T/Cmax,R.

 Полученные экспериментальные данные подвергались статистической обработке с помощью программы «Statistica» v 5.0 и EXCEL'97 для персонального компьютера. Рассчитывались следующие статистические параметры: среднее арифметическое значение, среднее геометрическое значение, стандартное отклонение среднего результата, границы доверительного интервала, проведено парное сравнение фармакокинетических параметров. Оценка биоэквивалентности проводилась применительно к параметрам AUCo-t, Cmax и Cmax/AUCo-t (натуральные и ln-преобразованные данные).

Результаты и обсуждение. Хроматографические характеристики приведенной методики количественного определения азитромицина в плазме крови приведены в табл. 1.

Таблица 1. Хроматографические характеристики метода анализа

 

Параметр

Значение

Время удерживания, мин

3,5

Коэффициент емкости

1,33

Число теоретических тарелок

4043

Степень извлечения, %

99,2

 

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки с использованием программного обеспечения ChemStation фирмы «Agilent». Калибровочную кривую получали в результате анализа проб сыворотки с добавками известных количеств азитромицина. Калибровочная зависимость носила линейный характер в диапазоне концентраций 0.001 – 5 мкг/мл (рис. 1). График описывался линейным уравнением Y=mx+b, где m=353033,27, b= -543,00. Коэффициент корреляции 0,99999. Предел обнаружения 0,5 нг/мл.

В табл. 2 приведены метрологические характеристики методики количественного определения азитромицина в плазме крови по результатам 6 параллельных измерений концентрации в образцах плазмы с добавками известных количеств анализируемых веществ.

Таблица 2. Метрологические характеристики методики определения азитромицина в плазме крови

 

Введено, мкг/мл

Найдено, мкг/мл

s, мкг/мл

sR

eR

0,01

0,0097±0,0004

0,0004

0,039

0,022

0,1

0,101±0,005

0,0045

0,045

0,01

1

0,98±0,03

0,025

0,025

0,02

 

На рис. 2 представлены хроматограммы контрольной плазмы (А), плазмы содержащей 0,1 мкгмл азитромицина (В), плазмы крови пациента через 2 часа после перорального приема препарата АЗИТРОМИЦИН отечественного производства (С).

На рис. 3 представлены средние значения концентрации азитромицина во времени (в линейных координатах) после однократного введения препаратов. Как видно из сравниваемых кривых характер зависимости «концентрация – время» практически не отличается. Максимальная концентрация препарата составляла для Азитромицина – 0,214+0,089 мкг/мл и для Сумамеда- 0,220 + 0,105 мкг/мл, время достижения максимальной концентрации для обоих препаратов было одинаковым 2,5 часа.

Таблица 3. Усредненные фармакокинетические параметры азитромицина после однократного приема препаратов в дозе 250 мг

 

Препарат

Сmax, мкг/мл

Tmax , ч

AUC0-t, мкгч/мл

T1/2, ч

Cmax/AUC0-t , ч-1

АЗИТРОМИЦИН

0,214+0,089

2,50+0,42

1,84

26,09

0,110

СУМАМЕД

0,220+0,105

2,50+0,45

1,94

24,25

0,111

 

Результаты расчетов фармакокинетических параметров препаратов Азитромицин и Сумамед представлены в табл. 3. Из таблицы видно, что значения всех рассчитанных параметров фармакокинетики статистически достоверно не отличаются. Так, площадь под фармакокинетической кривой (от нуля до последней точки забора крови) для препарата Азитромицин составляла – 1,84+0,4 мкг ч/мл, а для препарата Сумамед – 1,94+0,49 мкг.ч/мл. Остальные параметры фармакокинетики (T1/2, MRT, Cmax/AUCo-t) также были близкими. Среднее значение биодоступности (f¢) препарата Азитромицин по отношению к препарату Сумамед составляет 0,96+0,11 (доверительный интервал 0,90¸1,02). Значение относительной степени всасывания (f¢¢) для изучаемых препаратов составляет 0,99+0,17 (доверительный интервал 0,91¸1,108).

Таким образом, не выявлено статистически достоверных различий в процессе всасывания (как по полноте, так и по скорости всасывания) препаратов АЗИТРОМИЦИН и СУМАМЕД.

Список литературы

1. Вышковский Г. В. (ред.), Энциклопедия лекарств, ООО «РЛС-2002», Москва (2002), с. 58-59.

2. Kees F., Spangler S., Wellenbofer M., Chromatogr J. B: Biomed. Appl., 812(1-2), 287 - 293 (1998).

3. Raines D. A., Yusuf A., Jabak M. H. at al., Ther. Drug. Monit., 20(6), 680 – 684 (1998).

4. Shepard F. M., Dutha G. S., Ferraina R. A. at al., J. Chromatogr. B: Biomed. Appl., 565(1-2), 321-337 (1991).

5. Torano J. S., Guchelaar H. J., J. Chromatogr. B: Biomed. Appl., 729(1-2), 89 – 97 (1998).

6. Fonda H. G., Schneider R. F., Ther. Drug. Monit., 17(2), 179 – 183 (1995).

7. Методические рекомендации по проведению качественных клинических исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов, МЗ РФ, Москва (2001).


Об авторах

В. В. Писарев
ФГУП "Государственный научный центр по антибиотикам", Москва
Россия


Л. Б. Смирнова
ФГУП "Государственный научный центр по антибиотикам", Москва
Россия


Н. Е. Москалева
ФГУП "Государственный научный центр по антибиотикам", Москва
Россия


Ю. Б. Зверков
ФГУП "Государственный научный центр по антибиотикам", Москва
Россия


В. Г. Белолипецкая
Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины МЗ РФ, Москва
Россия


Я. В. Суханов
Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины МЗ РФ, Москва
Россия


Для цитирования:


Писарев В.В., Смирнова Л.Б., Москалева Н.Е., Зверков Ю.Б., Белолипецкая В.Г., Суханов Я.В. Определение азитромицина в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Клиническая фармакокинетика . 2004;(1):23-26.

Просмотров: 84


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2587-7836 (Print)
ISSN 2686-8830 (Online)