Разработан метод количественного определения азитромицина для ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Предел обнаружения препарата составляет 0,5 нг/мл. Метод был применен для изучения фармакокинетики и биоэквивалентности препарата Азитромицин (капсулы по 250 мг) в сравнении с препаратом Сумамед® (аналогичная лекарственная форма производства компании Плива, Хорватия). Фармакокинетическое исследование проводилось открытым перекрестным рандомизированным методом. В исследование были включены 18 добровольцев. Были рассчитаны фармакокинетические параметры, необходимые для оценки биоэквивалентности изучаемого препарата. Статистический анализ параметров фармакокинетики показал биоэквивалентность препаратов Азитромицин и Сумамед.

Азитромицин (9-деоксо-9а-аза-9а-метил-9а-гомоэритромицин (А) в виде дигидрата) – антибиотик широкого спектра действия. Наличие в его химической структуре атома азота позволяет отнести этот препарат к новой подгруппе макролидных антибиотиков – азалидам. По сравнению с другими макролидами обладает наиболее выраженным бактерицидным эффектом, способностью проникать в ткани, жидкости и клетки организма, максимальной длительностью периода полувыведения.

Азитромицин устойчив в кислой среде, благодаря чему быстро всасывается в желудочно-кишечном тракте (время достижения максимальной концентрации 2-3 ч). Высокий уровень всасывания обеспечивается и липофильностью молекулы азитромицина. После приема внутрь 500 мг препарата биодоступность составляет 37%. Максимальная концентрация в сыворотке после приема этой дозы 0,4 мг/л, однако в тканях и клетках концентрация в 10-50 раз выше, а в очагах инфекции на 24-34% больше, чем в здоровых тканях и коррелирует со степенью воспалительного отека.

Элиминация азитромицина из сыворотки проходит в два этапа: Т½ составляет 14-20 ч между 8 и 24 ч после приема препарата и 41 ч в интервале от 24 до 72 ч, что позволяет принимать препарат 1 раз в сутки [1].

В литературе имеется несколько публикаций, посвященных количественному определению азитромицина в биологических жидкостях методом ВЭЖХ. Так, в работах [2, 3, 4] анализ проводили методом ВЭЖХ с электрохимическим детектором и чувствительностью обнаружения препарата в плазме крови 10 нг/мл. В докладе [5] описаны условия определения азитромицина методом ВЭЖХ с детектором по флюоресценции. Чувствительность в этом случае составила 98,8 нг/мл. Авторами работы [6] приведены результаты сравнения методов ВЭЖХ с масс-спекрометрическим (химическая ионизация при атмосферном давлении) и электрохимическим детектированием, использованных для количественного обнаружения препарата в плазме крови. В этом исследовании удовлетворительная точность и воспроизводимость результатов анализа наблюдалась в диапазоне концентраций 10 – 250 нг/мл и оба метода показали хорошую корреляцию между собой.

В работе использовали следующие реактивы: ацетонитрил 1-го сорта («Криохром», Санкт-Петербург), муравьиная кислота (Merck), ацетат аммония и ацетат натрия (Merck).

Хроматографическое разделение осуществляли на колонке Eсlipse SB-C18, 5 мкм, 4,6 х 150 мм (США) при температуре 70°С. Элюирование проводили в изократическом режиме. Состав подвижной фазы: ацетонитрил - 0,1 M ацетат аммония – 0,002 M ацетат натрия (60:20:20, об/об). Скорость потока 0,7 мл/мин.

В масс-спектре азитромицина полученном при ионизации вещества в электроспрее на приборе с одним квадрупольным анализатором наблюдался интенсивный пик с m/z 749,1 соответствующий протонированному молекулярному иону [М+H]+ и с m/z 771,5 - иону аддукта [М+Nа]+. Параметры работы детектора подбирались для достижения максимального выхода аддукта [М+Nа]+ : фрагментор 200, напряжение капилляра 4500 В, температура газа 3500С, скорость 12,0 л/мин, давление небулайзера 40 psig.

Для выделения азитромицина из плазмы крови и очистки экстракта использовался метод твердофазной экстракции. Картридж предварительно промывали последовательно 1 мл ацетонитрила и 2 мл 10% водного раствора ацетонитрила. К 1 мл плазмы добавляли 0,5 мл ацетонитрила, перемешивали на vortex 2 минуты, центрифугировали 5 минут при 13 000 об/мин. Супернатант переносили в картридж. Картридж промывали 1 мл 10% водного раствора ацетонитрила, затем элюировали азитромицин 4 мл смеси ацетонитрил – 0,01 М ацетат натрия – муравьиная кислота (90 : 10 : 0,1, об/об). Полученный элюат упаривали досуха под вакуумом при температуре 60˚С. Пробу растворяли в 200 мкл метанола и аликвоту 50 мкл переносили в хроматограф. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки с использованием программного обеспечения Chemstation фирмы «Agilent».

Разработанный метод был применен для изучения фармакокинетики и биоэквивалентности препарата АЗИТРОМИЦИН капсулы отечественного производства содержащие 250 мг азитромицина в сравнении с препаратом Сумамед®, фирма «Плива» (Хорватия). В исследование были включены 18 добровольцев. Фармакокинетическое исследование проводили открытым перекрестным рандомизированным методом в 2 этапа с интервалом между приемами препаратов 14 дней. Образцы крови в количестве 4 мл отбирали из кубитальной вены через 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 5; 8; 12; 24; 48 и 60 часов после приема препарата. Анализ фармакокинетических данных и оценка биоэквивалентности исследуемых препаратов проведены в соответствии с методическими рекомендациями по проведению качественных клинических исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов [7].

Фармакокинетические параметры рассчитывали с помощью программы «ESTRIP» модельно-независимым методом. Были рассчитаны следующие параметры: максимальная концентрация Cmax препаратов в крови (максимальное измеренное значение); время достижения максимальной концентрации Tmax; площадь под фармакокинетической кривой AUCo-t; площадь под фармакокинетической кривой AUCo-¥; период полувыведения T1/2; среднее время удержания препаратов в системном кровотоке MRT; относительная скорость всасывания Cmax/AUCo-t. Для оценки исследуемого препарата рассчитывали f¢ - относительную биодоступность исследуемой лекарственной формы азитромицина по отношению к сравниваемой, определяемую отношением AUCo-t,T/AUC0-t,R и f¢¢ - относительную степень всасывания азитромицина, определяемая отношением Cmax,T/Cmax,R.

 Полученные экспериментальные данные подвергались статистической обработке с помощью программы «Statistica» v 5.0 и EXCEL'97 для персонального компьютера. Рассчитывались следующие статистические параметры: среднее арифметическое значение, среднее геометрическое значение, стандартное отклонение среднего результата, границы доверительного интервала, проведено парное сравнение фармакокинетических параметров. Оценка биоэквивалентности проводилась применительно к параметрам AUCo-t, Cmax и Cmax/AUCo-t (натуральные и ln-преобразованные данные).

Таблица 1. Хроматографические характеристики метода анализа

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки с использованием программного обеспечения ChemStation фирмы «Agilent». Калибровочную кривую получали в результате анализа проб сыворотки с добавками известных количеств азитромицина. Калибровочная зависимость носила линейный характер в диапазоне концентраций 0.001 – 5 мкг/мл (рис. 1). График описывался линейным уравнением Y=mx+b, где m=353033,27, b= -543,00. Коэффициент корреляции 0,99999. Предел обнаружения 0,5 нг/мл.

В табл. 2 приведены метрологические характеристики методики количественного определения азитромицина в плазме крови по результатам 6 параллельных измерений концентрации в образцах плазмы с добавками известных количеств анализируемых веществ.

Таблица 2. Метрологические характеристики методики определения азитромицина в плазме крови

На рис. 2 представлены хроматограммы контрольной плазмы (А), плазмы содержащей 0,1 мкгмл азитромицина (В), плазмы крови пациента через 2 часа после перорального приема препарата АЗИТРОМИЦИН отечественного производства (С).

На рис. 3 представлены средние значения концентрации азитромицина во времени (в линейных координатах) после однократного введения препаратов. Как видно из сравниваемых кривых характер зависимости «концентрация – время» практически не отличается. Максимальная концентрация препарата составляла для Азитромицина – 0,214+0,089 мкг/мл и для Сумамеда- 0,220 + 0,105 мкг/мл, время достижения максимальной концентрации для обоих препаратов было одинаковым 2,5 часа.

Таблица 3. Усредненные фармакокинетические параметры азитромицина после однократного приема препаратов в дозе 250 мг

Результаты расчетов фармакокинетических параметров препаратов Азитромицин и Сумамед представлены в табл. 3. Из таблицы видно, что значения всех рассчитанных параметров фармакокинетики статистически достоверно не отличаются. Так, площадь под фармакокинетической кривой (от нуля до последней точки забора крови) для препарата Азитромицин составляла – 1,84+0,4 мкг ч/мл, а для препарата Сумамед – 1,94+0,49 мкг.ч/мл. Остальные параметры фармакокинетики (T1/2, MRT, Cmax/AUCo-t) также были близкими. Среднее значение биодоступности (f¢) препарата Азитромицин по отношению к препарату Сумамед составляет 0,96+0,11 (доверительный интервал 0,90¸1,02). Значение относительной степени всасывания (f¢¢) для изучаемых препаратов составляет 0,99+0,17 (доверительный интервал 0,91¸1,108).

Таким образом, не выявлено статистически достоверных различий в процессе всасывания (как по полноте, так и по скорости всасывания) препаратов АЗИТРОМИЦИН и СУМАМЕД.