Изучение эффектов леветирацетама и нового производного 4-фенилпирролидона ГИЖ-290 в закрытом крестооразном лабиринте у мышей линий BALB/c и C57BL/6

Введение

Леветирацетам ((S)-2-(2-оксопирролидин-1-ил) бутанамид) является противоэпилептическим препаратом 2-го поколения, используемым в лечении эпилепсии как у детей, так и у взрослых. Соединение ГИЖ-290 (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил) уксусной кислоты) имеет сходство по химическому строению с леветирацетамом и синтезирован в Отделе химии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (зав. член-корр. РАН профессор Гудашева Т.А.). Установлено, что ГИЖ-290 обладает выраженным противосудорожным действием и превосходит леве-тирацетам по активности и эффективности и, кроме того, ГИЖ-290 оказывает положительное влияние на обучаемость и воспроизведение навыка в тесте «водного лабиринта Морриса» [1]. Известно, что течению эпилепсии сопутствуют поведенческие и психиатрические отклонения, в частности тревожность, депрессия и нарушение когнитивных функций [2, 3]. Адекватной моделью для исследования этих поведенческих нарушений в эксперименте является методика «закрытого крестообразного лабиринта», при использовании которой установлено, что мыши линии BALB/c характеризуются в сравнении с мышами линии C57BL/6 когнитивным дефицитом и повышенной тревожностью [4].

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния леветирацетама и соединения ГИЖ-290 на спектр поведенческой активности мышей BALB/c и C57BL/6 в условиях теста «закрытый крестообразный лабиринт». 

Материалы и методы

Исследования проводили на самцах мышей линий C57BL/6 и BALB/c массой 25—30 г, которые были поставлены питомником «Столбовая» (Московская обл., РФ) и были помещены в условия с контролируемой постоянной температурой и влажностью (40—60%) воздуха, регулярно сменяемым циклом «день-ночь» (12 ч — 12 ч), свободным доступом к воде и еде. Организация экспериментов соответствовала этическим нормам, регламентирующим эксперименты на животных (Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях: EST № 123 от 18 марта 1986 г., Страсбург; Об утверждении правил лабораторной практики: приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19 июня 2003 г. М., 2003).

Препараты применяли в дозах, соответствующих их противосудорожному эффекту [1]. Леветирацетам (600 мг/кг/день) и соединение ГИЖ-290 (5 мг/кг/ день) вводили внутрибрюшинно, в течение 5 дней. Вещества растворяли в физиологическом растворе. Контрольным животным вводили 0,9% NaCl.

Тест закрытого крестообразного лабиринта (ЗКЛ) основан на врождённой способности мышей к спонтанному поведению в незнакомой обстановке, исключающей элемент предварительного обучения, преимуществом которого является минимальная степень инвазивности [4, 5]. Закрытый крестообразный лабиринт состоял из 4 пластмассовых закрытых пустых отсеков, соединённых с центральным отсеком с помощью входных отверстий. Мышь помещали в центральный отсек лабиринта и в полуавтоматическом режиме с помощью программы Bеhаviour регистрировали последовательность и продолжительность её переходов из одного рукава в другой. Последующий анализ данных позволял выделить ряд показателей эффективности исследовательского поведения (когнитивные функции), тревожности и двигательной активности.

Показатели величины 1-го цикла патрулирования (F_PtrN) и числа циклов патрулирования (PatrN) используются для оценки ноотропного действия веществ: чем больше число заходов требуется мыши, чтобы посетить все 4 боковых рукава (совершить один цикл патрулирования), тем менее «систематично» и менее эффективно исследование лабиринта. Число циклов патрулирования, совершённых за время эксперимента, ещё один показатель эффективности исследовательского поведения. Чем больше циклов патрулирования, тем более «систематично» и более эффективно исследование лабиринта животным.

Латентный период (F_ChTm) и продолжительность 1-го визита в боковой отсек (F_GITm) — показатели, которые отражают уровень тревожности животного в новой обстановке и могут рассматриваться как показатель баланса между любопытством и тревогой животного в новой обстановке. Эти показатели отрицательно коррелируют с продолжительностью пребывания животного в открытых рукавах в известном тесте приподнятого крестообразного лабиринта, что позволяет использовать избирательное изменение этих показателей в качестве индикатора тревожности.

Общее время, проведённое животным в центральном и боковых отсеках лабиринта (T_ChTm и T_GITm) — это показатели, которые отражают уровень двигательной активности, а также характеризуют интенсивность обследования новой среды и могут быть использованы для оценки стимулирующего (тимолептического) или, наоборот седативного эффекта веществ.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Statistica 6.0 с привлечением методов параметрической и непараметрической статистики (t-тест Стьюдента, тест Манна- Уитни, критерий Колмогорова-Смирнова, тест Вальда— Вольфовица).

Результаты

Анализ поведенческих параметров мышей контрольных групп обеих инбредных линий C57BL/6 и BALB/c подтвердил наличие межлинейных различий, описанных нами ранее [4]: мыши C57BL/6 превосходили мышей линии BALB/c по ноотропной активности, оцениваемой по эффективности исследовательской (более высокое количество полных обходов всех боковых отсеков, PatrN) и уступали по общей двигательной активности (большее суммарное время нахождения в отсеках за сессию, T_GITm), тогда как мыши линии BALB/c проявляли существенно большую тревожность в незнакомой обстановке (меньший латентный период 1-го захода в боковой отсек, (F_ChTm) (табл. 1).

Леветирацетам (600 мг/кг/день, 5 дней) не обладал ноотропной активностью у мышей BALB/c, что выражалось в отсутствии изменения показателей: числа заходов 1-го цикла (F_PtrN, 5,92±0,46 против 6,15±0,54 в контроле) и числа полных обходов (PatrN, 1,85±0,19 против 1,77±0,12 в контроле). У мышей C57BL/6 ле-ветирацетам не влиял на 1-й показатель ноотропной активности (F_PtrN), однако уменьшал число полных обходов с 2,25±0,11 до 1,67±0,12 (р < 0,05; Student’s t-test), что означает ухудшение эффективности ис-следовательской активности, а следовательно и ког- нитивных функций (табл. 1). Соединение ГИЖ-290 (5 мг/кг/день, 5 дней) не оказывало влияния на показатели, отражающие ноотропный эффект (см. табл. 1).

У мышей BALB/c, исходно более тревожных в не-знакомой обстановке теста, леветирацетам ещё более увеличивал латентное время 1-го захода (с 9,73+2,06 с в контроле до 19,03+3,34 с в опыте;p < 0,05), что свидетельствует о способности леветирацетама повышать уровень тревожности (см. табл. 1). Леветирацетам не изменял уровень тревожности у мышей линии C57BL/6, а ГИЖ-290 не изменял показатели тревожности у мышей обеих линий.

Леветирацетам и ГИЖ-290 у мышей BALB/c повышали показатель общего времени пребывания в боковых отсеках, соответственно до 154,73+19,48 с и 143,78+13,51 с по сравнению с контролем (107,45+11,07 с; p < 0,05), что отражало снижение двигательной активности. Кроме того, у мышей C57BL/6 леветирацетам повышал показатель общего времени пребывания и в центральном отсеке: с 37,78+1,84 с в контроле до 45,61+2,19 с в опыте (см. табл. 1).

Изменение профилей поведенческой активности мышей линий BALB/c и C57BL/6 под влиянием леветирацетама и ГИЖ-290 представлены на рис. 1. Из представленных графиков следует, что эффекты обоих веществ во многом зависят от исходного поведенческого паттерна линии мышей. Так, у мышей BALB/c, исходно характеризующихся высокими уровнями тревожности и двигательной активности, леветирацетам способствовал ещё большему усилению тревожности (+96% относительно контроля, рис. 1, а), тогда как ГИЖ-290 не оказывал влияния на тревожность (рис. 1, б). При этом оба вещества не изменяли показателей тревожности у мышей линии C57BL/6 (рис. 1, в, г).

Качественное совпадение эффектов наблюдалось и в отношении двигательной активности: у мышей BALB/c как леветирацетам, так и ГИЖ-290 она снижалась за счёт возрастания суммарного времени пребывания в боковых отсеках лабиринта T_GlTm на 44 и 34% (см. рис. 1, а, б), соответственно. У мышей C57BL/6, спонтанно менее «быстрых», некоторое снижение перемещений по показателю суммарного времени пребывания в центральном отсеке (T_ChTm) вызывал лишь леветирацетам. 

В этой же группе мышей было обнаружено ухудшение показателя эффективности исследовательского поведения (-26%) (рис. 1, в).

Таким образом, леветирацетам (600 мг/кг/день, 5 дней, в/б) у мышей BALB/c усиливал тревожность и снижал двигательную активность, а у мышей линии C57BL/6 ухудшал когнитивные функции и уменьшал двигательную активность (табл. 2). Соединение ГИЖ-290 (5 мг/кг/день, 5 дней, в/б) существенно не изменяло профилей поведения мышей линий BALB/c и C57BL/6, за исключением снижения двигательной активности у мышей линии BALB/c (см. табл. 2).

Известно, что наиболее типичными психиатрическими расстройствами при эпилепсии являются тревожность, депрессия, эмоциональная лабильность, ажитация, враждебность [2, 6] и когнитивный дефицит [7]. В настоящем исследовании показано, что леветирацетам может усиливать эти патологические состояния, что подтверждается отдельными клиническими наблюдениями [8—10]. Соединение ГИЖ-290 не оказывает существенного влияния на психоэмоциональные показатели поведения мышей как линии BALB/c, так и линии C57BL/6, демонстрирующих различные паттерны поведения в тесте закрытого крестообразного лабиринта, что позволяет предполагать отсутствие у него негативного влияния на психиатрические коморбидные состояния, сопровождающие эпилепсию у пациентов, и свидетельствует о преимуществе нового соединения перед леветирацетамом.

Выводы

1.Леветирацетам (600 мг/кг/день, 5 дней, в/б) в тесте закрытого крестообразного лабиринта у мышей линии BALB/c усиливает тревожность и снижает двигательную активность, а у мышей линии C57BL/6 ухудшает когнитивные функции и уменьшает двигательную активность.

2.Соединение ГИЖ-290 (5 мг/кг/день, 5 дней, в/б) в тесте закрытого крестообразного лабиринта не оказывает влияния на уровень тревожности и на когнитивные функции у мышей линий BALB/c и C57BL/6 и лишь незначительно понижает двигательную активность у мышей линии BALB/c.