Роль 3-оксиметаболита феназепама и леваны в реализации их нейротропного действия

Введение

Бензодиазепиновые анксиолитики широко применяются в лечебной практике уже более 50-ти лет [2, 3, 17, 20]. В течение всего периода изучения этих веществ особое внимание уделяется их 3-замещенным производным [11, 18, 21, 25]. Объясняется это следующими причинами: во-первых, наличием заместителей в положении 3 гетерокольца у таких препаратов как лоразепам, оксазепам, хлоразепат, темазепам, мендон. Во-вторых, большинство из существующих препаратов в процессе метаболизма (гидроксилирования или гидролиза) образуют соответствующий 3-оксиметаболит (3-ОМ). В литературе [8, 11, 26] обсуждается роль 3-ОМ в проявлении нейротропного действия исходных соединений в эксперименте на животных и при лечении пациентов. В одних случаях препараты проявляли свойства пролекарств, в других оказывали совместное действие с метаболитом.

Феназепам (I) и левана (II) обладают широким спектром фармакологического действия, проявляя анксиолитический, седативный, снотворный, противосудорожный, противогипоксический, миорелаксантный эффекты [5, 6]. В медицинской практике феназепам используется в основном как анксиолитическое средство, а левана (циназепам) как снотворное [1, 2, 5, 6].

В процессе метаболизма препаратов образуется один и тот же метаболит III – 3-ОМ. Однако, феназепам превращается в метаболит в процессе гидроксилирования, катализируемого некоторыми изоформами цитохрома Р450 (CYP), а левана в результате гидролиза сложной эфирной связи карбоксилэстеразой.

Цель исследования

Цель работы – это проведение сравнительного анализа фармакологического действия и интегральных показателей фармакокинетики феназепама, леваны и их активного метаболита (3-ОМ), образующегося в организме экспериментальных животных различными биохимическими механизмами.

Материалы и методы исследования

В работе были использованы белые беспородные мыши-самцы (20-23 г), содержащиеся в стандартных условиях вивария. Содержание животных в виварии осуществлялось в соответствии с правилами лабораторной практики и Приказу Минздравсоцразвития РФ №708н от 23 августа 2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Работа осуществлялась согласно этическим нормам, регламентирующим эксперименты на животных в соответствии с международными и российскими нормативно-правовыми документами («Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях: EST № 123» от 18 марта 1986 г. Страсбург, 1986; «Об утверждении правил лабораторной практики: приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации» № 267 от 19 июня 2003 г.

В работе использованы субстанции феназепама, леваны и 3-ОМ, и их ¹⁴С-радиоактивные аналоги (0,28 мкКю/моль), меченные по положению «2» гетерокольца, синтезированные по методу [9]. Соединения вводились перорально или внутрибрюшинно в твиновой эмульсии в эквимолярных дозах (10 мкмоль/кг).

Методы изучения фармакологических эффектов

Противосудорожное действие оценивали по антагонизму с судорожными агентами – коразолом (в дозе 110 мг/кг подкожно за 10 мин до развития максимального эффекта исследуемого соединения), тиосемикарбазидом (24 мг/кг внутрибрюшинно через 15 мин после введения соединений и оценкой выживания животных в течение 90 мин), а также по способности предупреждать тонико-экстензорный припадок у мышей при пропускании переменного тока (50 Гц, 50 мА, длительность 0,2 c) через корнеальные электроды [7]. Влияние веществ на координацию движений оценивали в тесте «вращающегося стержня» [7, 22], а снотворное действие – в тесте потенцирования гексеналового сна [4]. Гексенал вводили в дозах 30-60 мг/кг внутрибрюшинно, через 15 мин после введения исследуемых препаратов и в дальнейшем регистрировали время наступления сна у животных по критерию утраты рефлекса переворачивания и длительность сна по восстановлению рефлекса переворачивания. Результаты обрабатывали с помощью статистического пакета программы MS Excel и представляли в виде ЭД₅₀ (эффективная доза, вызывающая эффект у 50% животных) и доверительных границ ЭД₅₀ с использованием фактора fЭД₅₀ по методу Lithfield, Wilcoxon. Достоверность различий определяли при Р < 0,05.

Методы изучения фармакокинетики соединений

Через определённые промежутки времени после введения радиоактивных соединений животных подвергали хлороформному наркозу, декапитировали и собирали кровь в предварительно гепаринизированые центрифужные пробирки. Извлеченный и взвешенный головной мозг гомогенизировали в изотоническом растворе (NaCl, 0,9%, 1:4 масса:объём). Для определения содержания общего радиоактивного материала в крови и гомогенате мозга отбирали их аликвоты, которые переносили во флаконы для жидкостной сцинтилляционной фотометрии, добавляли 1 см³ смеси Тритон Х-100:ксилол (1:1) и обрабатывали, как указано ниже. Установление качественного и количественного состава метаболитов проводили методом тонкослойной препаративной радиохроматографии, по описанной ранее методике [8]. Содержания радиоактивного материала определяли на приборе Canberra Packard TRI CARB 2700 и выражали в нмоль/г (для головного мозга) или нмоль/см³ (для крови). Методом статистических моментов рассчитывали площадь под фармакокинетической кривой (AUC_0-µ), среднее время удержания (MRT), константу элиминации (k_el), объём распределения (V_dss) и общий клиренс (Cl_total) препаратов [12, 13].

Результаты исследования и их обсуждение

Противосудорожное действие производных 1,4-бенздиазепина реализуется не только за счёт внутренней активности соединения, но и в результате увеличения аффинитета рецепторного комплекса к медиатору (ГАМК) и генерализованного торможения ЦНС благодаря гиперполяризации ГАМК-чувствительных нейронов [23]. Оценка этих процессов возможна на моделях введения антагонистов/обратных агонистов бенздиазепиновых рецепторов (коразол, бикукуллин, пикротоксин) и ингибиторов синтеза эндогенной ГАМК (тиосемикарбазид), а также по способности веществ блокировать вовлечение структур мозга в общий процесс возбуждения на модели максимального электрошока.

Установлено, что левана по антагонизму с коразолом обладает в 3,2 раза меньшей активностью, чем феназепам и в 9 раз уступает по активности своему метаболиту. По антагонизму с тиосемикарбазидом феназепам также в 3,6 раза более активен в сравнении с левадой, тогда как активность 3-ОМ выше всего в 2,3 раза (табл. 1). Таким образом, левана проявляет выраженную противосудорожную активность по антагонизму с ГАМК-ергическими антагонистами, демонстрируя как аффинитет к бенздиазепиновым рецепторам (антагонизм с коразолом), так и наличие внутренней активности (антагонизм с тиосемикарбазидом).

Таблица 1

Нейротропная активность (ЭД₅₀ мкмоль/кг) феназепама, леваны и 3-ОМ

Полученные данные подтверждают результаты исследования специфического связывания этих соединений с ГАМК-рк синаптосом мозга животных [15]. Величины связывания (K_i) составляют для веществ I-III, соответственно, 2,1 ± 0,1; 1,8 ± 0,1 и 81 ± 1 нмоль. Представленные результаты свидетельствуют о более существенном вкладе активного метаболита 3-ОМ в реализацию ГАМК-миметического действия веществ. Вместе с тем, противосудорожное действие леваны в тесте антагонизма с максимальным электрошоком проявляется в дозах, на порядок превышающих её эффект в тесте антагонизма с коразолом (в ~ 30 раз). Феназепам и 3-ОМ в данном тесте проявляют меньшую активность (табл. 1). В тесте потенцирования гексеналового сна феназепам и левана показывают одинаковую активность.

По проявлениям миорелаксантного действия, которое рассматривается как побочный эффект бенздиазепинов, левана имеет меньшую активность (статистически достоверно при р£0,05) в сравнении с феназепамом (в 5,4 раза, t_расч. = 3,85) и 3-ОМ (в 2,5 раза, t_расч. = 2,79).

О высокой избирательности противосудорожного действия леваны свидетельствуют также значительные величины терапевтических индексов, вычисляемые соотношением ЭД₅₀ миорелаксантного действия (неврологический дефицит) и ЭД₅₀ противосудорожных эффектов: по антагонизм с коразолом этот показатель составляет 23,8 ± 8,3, а по антагонизму с тиосемикарбазидом 26,2 ± 6,1. Для феназепама показатели терапевтического индекса по этим тестам составляют, соответственно, 14,1 ± 2,6 и 17,5 ± 3,3, а для 3-ОМ – 83,3 ± 16,1 и 23,1 ± 4,7, соответственно, и, следовательно, по величинам терапевтических индексов левана превосходит феназепам.

Таким образом, в тестах по предупреждению судорог, вызванных коразолом и тиосемикарбазидом, левана значительно уступает по своей активности феназепаму, однако по антагонизму с максимальным электрошоком левана превосходит феназепам. Нарушение координации движения у животных при введении препаратов в эквимолярных дозах было более выражено у феназепама. Сопоставление эффектов феназепама и левады с эффектами 3-ОМ свидетельствует о большем сходстве 3-ОМ с феназепамом.

Полученные данные не позволяют однозначно утверждать о конкретном вкладе 3-ОМ в реализацию фармакологического действия феназепама или леваны. Не исключена возможность, что объяснение этому могут дать исследования фармакокинетики соединений, которые включают анализ их всасывания (желудочно-кишечный тракт ® кровь), нейродоступности (кровь ® головной мозг) и метаболизма (возможно, стереоселективного).

Фармакокинетические исследования (табл. 2 и 3) показали существенные различия в распределении соединений между головным мозгом и кровью. Так, липофильное соединение I (log P=3,29) в большем количестве регистрируются в головном мозге, тогда как в крови его концентрация существенно меньше (для феназепама AUC в мозге 309 ± 74 нмоль/см³*ч, в крови – 106 ± 17 нмоль/см³*ч). В то же время, для распределения вещества II отмечается обратная зависимость и его концентрация в крови статистически недостоверно выше, чем в головном мозге. Для указанных соединений характерно высокое значение V_dss – для феназепама 1007 ± 304 см³/кг (по данным содержания в крови) и 938 ± 492 г/кг (по данным в головном мозге), тогда как для 3-ОМ составляет 1658 ± 106 см³/кг (по данным содержания в крови) и 730 ± 167 г/кг (по данным в головном мозге).

Таблица 2

Фармакокинетические параметры феназепама, леваны и 3-ОМ, после их перорального введения (по данным концентрации веществ в головном мозге)

Таблица 3

Фармакокинетические параметры феназепама, леваны и 3-ОМ, после их перорального введения (по данным концентрации веществ в крови)

Среднее время удержания 3-ОМ в крови также существенно различается в зависимости от того, вводится ли он индивидуально (14,1 ± 0,7 ч), либо образуется после введения феназепама (12,9 ± 2,1 ч) или леваны (5,7 ± 0,4 ч). В то же время, аналогичные показатели MRT для 3-ОМ по данным в головном мозге не носят статистически достоверных отличий.

К основным путями метаболизма производных 1,4-бенздиазепина относятся окислительные реакции, катализируемые различными изоформами цитохрома P450 (CYP450). Они включают процессы N¹-деалкилирования (при наличии соответствующего заместителя), С³-гидроксилирования и окисления ароматических ядер, протекающие преимущественно в печени [2, 25]. Наличие сложной эфирной связи в молекуле леваны делает это соединение субстратом карбоксилэстераз, локализующихся в печени, крови и мозге [24]. В обоих случаях с кровью соединения I, II и их метаболит (3-ОМ) проникают через гематоэнцефалический барьер в головной мозг (биофазу действия). Поскольку этот процесс осуществляется механизмом простой диффузии, то его скорость и конечный результат (соотношение концентраций «С_мозг/С_кровь») зависят от физико-химических свойств этих веществ. В молекуле леваны карбоксильная группа способна к обратимой ионизации, за счёт чего устанавливается равновесие между ионизированной и неионизированной формами. Ионизированная форма хорошо растворима в биологических жидкостях (кровь, межклеточная жидкость), неионизированная (липофильная) более быстро диффундирует через гидрофобные участки биологических мембран. Благодаря этому левана легко проникает через гематоэнцефалический барьер и уже в тканях мозга подвергается гидролизу неспецифическими карбоксилэстеразами.

Проявление нейроактивных компонентов фармакологического спектра соединений в организме обусловлено как аффинностью к рецепторам, так и их концентрацией в биофазе действия. Поэтому предложенный механизм поступления леваны в головной мозг, гидролиз и последующее локальное увеличение концентрации 3-ОМ может объяснить особенность психофармакологической активности этого препарата.

Благодаря наличию сложноэфирой группы в молекуле леваны возможен её гидролиз и высвобождение активного 3-ОМ, увеличение концентрации которого в головном мозге может быть причиной изменения соотношения компонентов фармакологического спектра леваны по сравнению с феназепамом.

Рассматриваемые препараты близки по интегральным показателям распределения (V_dss) и элиминации (k_el и Cl_общ.), что обусловлено их высокой липофильностью (табл. 2 и 3). Преимущественное накопление в липофильной ткани (головной мозг) также приводит к тому, что среднее время удержания феназепама в головном мозге в 2,7 раза выше, чем в крови. Наоборот, для леваны, как более гидрофильного соединения, подвергающегося гидролизу, среднее время удержания значительно меньше и составляет 4,7 ± 0,5 ч как в головном мозге, так и в крови. Вследствие этого для леваны отмечается более высокое значение общего клиренса (в 1,5 раза выше для мозга и в 4,5 раза выше для крови по сравнению с феназепамом).

Образующийся 3-ОМ, в дальнейшем подвергается конъюгации с образованием неактивных водорастворимых метаболитов и элиминации из организма [10]. Благодаря этому его общий клиренс в крови в 2,2 раза выше, чем в мозге (117,6 ± 4,5 нмоль/см³*ч) выше, чем в головном мозге (53,1 ± 10,4 нмоль/г*ч) – транспорт 3-ОМ с кровью в печень увеличивает эффективность образования глюкуроновых и сульфатных конъюгатов.

Одним из показателей эффективности поступления веществ в головной мозг является соотношение концентраций «С_мозг/С_кровь». Для 3-ОМ это соотношение составляет 0,86 ± 0,09 и обусловлено его физико-химическими свойствами и способностью проникать через гематоэнцефалический барьер. После введения леваны соотношение «С_мозг/С_кровь» для 3-ОМ гораздо выше и составляет 2,6 ± 0,2. Такое существенное различие может быть объяснено сочетанием нескольких факторов: 1) повышенной способностью леваны проникать через гематоэнцефалический барьер и 2) гидролитическим расщеплением леваны в тканях мозга и высвобождением 3-ОМ. Аналогичный показатель для 3-оксифеназепама, образующегося при метаболизме феназепама, составляет 0,96 ± 0,27 и близок к величине распределения между кровью и мозгом самого 3-ОМ. Как было указано, метаболизм феназепама протекает преимущественно в печени и поступление в головной мозг исходного соединения и 3-ОМ осуществляется путём простой диффузии через гематоэнцефалический барьер. Ещё одной причиной, обусловливающей особенности фармакологического спектра леваны, может быть стереоселективность гидролиза препарата. Отметим, что в результате гидроксилирования феназепама и гидролиза леваны возможно образование R и S энантиомеров 3-ОМ. Однако, для них характерен очень быстрый процесс рацемизации, поэтому определить вклад каждого из них в определённый вид активности не представляется возможным. Что касается структуры леваны, то она изначально имеет в 3-м положении молекулы асимметрический атом и существует в виде S и R энантиомеров. Не исключена возможность, что определённая изоформа карбоксилэстеразы гидролизует лишь один из энантиомеров, не затрагивая другой. Такой вариант гидролиза был продемонстрирован [14] при энантиоселективном гидролизе микросомальной фракцией печени 3-ацетокси-7-бром-1-метил-5-фенил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она, вещества близкого по строению леване. Авторами выделен S-энантиомер рацемического субстрата, что свидетельствует о большей специфичности карбоксилэстеразы к R-энантиомеру. Не исключена возможность, что этот энантиомер обладает большим сродством к ГАМК-рк, чем рацемат леваны, как это происходит в случае близкого по структуре соединения – гемисукцината оксазепама, изомер которого обладает ярко выраженным действием на ЦНС [16]. Изначально, образование разного количества энантиомеров влияет на характер их распределения, изменяя степень связывания с транспортными белками крови [19], отсюда и изменение фармакологической активности изначально рацемической смеси исходного препарата леваны.

Соотношение площадей препарата в головном мозге и крови является количественной оценкой способности проникать через ГЭБ. Однако для леваны это соотношение составляет 0,52 ± 0,06 вследствие гидролиза в тканях мозга. Благодаря этому соотношение AUC в мозге и крови для 3-ОМ (после введения леваны) составляет 1,4 ± 0,1, аналогичный показатель для 3-ОМ, образующегося при введении феназепама, составляет 0,96 ± 0,27, а при введении индивидуального 3-ОМ – 0,86 ± 0,09, что также подтверждает предложенную ранее схему поступления и гидролиза леваны в головном мозге.

Заключение

Учитывая вышеизложенное можно предположить, что оригинальный фармакологический спектр леваны в значительной степени обусловлен особенностями её фармакокинетики (способность проникать через гистогематические барьеры), а также комбинацией стереоселективности гидролиза и накоплением в тканях головного мозга активного метаболита 3-ОМ.