Исследование острой и хронической токсичности готовой лекарственной формы ГК-2

Введение

Гликопептиды повышают общую сопротивляемость организма животного к патогенному фактору, прежде всего за счёт активации клеток фагоцитарной системы иммунитета (нейтрофилов и макрофагов). Последние путём фагоцитоза уничтожают патогенные микроорганизмы и, в то же время, секретируют медиаторы естественного иммунитета – цитокины, которые, воздействуя на широкий спектр клеток-мишеней, вызывают дальнейшее развитие защитной реакции организма [1–2].

Препарат, создаваемый на основе гликопептидов молочнокислых бактерий, планируется применять для профилактики и лечения инфекционных заболеваний; для снятия поствакцинальных осложнений и стрессового состояния [3].

Исследование токсических свойств синтетических и природных гликопептидов, проведённое в 70–80-е годы прошлого столетия, привело к созданию ряда синтетических фармацевтических препаратов нового класса – иммуномодуляторов. Учитывая высокую токсичность синтетических гликопептидов, нами были проведены дополнительные исследования безвредности природных гликопептидов, выделенных из различных видов молочнокислых бактерий [4–5].

Проведённые исследования показали значительно более низкую токсичность и аллергенность природных гликопептидов по сравнению с синтетическими фармакопейного качества.

Гликопептиды — это один из компонентов клеточной стенки бактерий, в частности, лактобацилл. Природные состоят из гликозидной (N-ацетил глюкозоаминил - N'- ацетилмурамил) и пептидной части.

Аминокислотный состав пептидной части, выделенных из одного ряда лактобактерий (палочкообразных) содержит от двух (обязательных — L – аланил – D – изоглутамин) до семи аминокислот. Состав синтетических гликопептидов — строго определён как гликозидной частью, выделяемой из стенок бактерий, так и двумя «пришитыми» аминокислотами L – аланил и D – изоглутамин.

Целью настоящей работы является изучение токсичности и аллергенности природных гликопептидов молочнокислых бактерий на лабораторных животных.

Материалы и методы

Исследования выполнены во ВНИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных в соответствии с «Инструкцией о гигиенических требованиях к новым препаратам химического и биологического синтеза, предполагаемым для использования в составе рациона или для консервации кормов сельскохозяйственных животных, продукция от которых идёт в пищу населения» [8] (утверждена 14 декабря 1981 г.) и «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» [9].

Исследования были проведены на мышах и кроликах.

При изучении патогенности, определении средней смертельной дозы, токсичности и токсигенности гликопептидов эксперименты проводили на мышах обоего пола со стандартной живой массой тела 22–25 г.

Мышей содержали в виварии института в стандартных клетках, они получали полноценный рацион (ОР), состоящий из специального комбикорма ПК-121-1 (для лабораторных мышей и крыс) по 10 г на голову в сутки.

Определение среднесмертельной дозы. Из мышей было сформировано 4 группы по 10 особей в каждой группе. Контрольная (1-ая) группа получала ОР (добавок не получала), изучаемый препарат вводили с кормом в дозах: 0,05 мг/мышь (2-я группа – рекомендуемая доза), 0,5 мг/ мышь (3-я группа – десятикратная доза) и 5,0 мг/мышь (4-я группа – стократная доза) на протяжении 7 суток.

Аналогично проводились испытания инъекционного препарата. Из мышей было сформировано 4 группы по 10 особей в каждой (5 самок и 5 самцов). Подопытным мышам (6–8-я группы) внутрибрюшинно вводили препарат в рекомендуемой, десятикратной и стократных дозах в объёме 0,5 мл, а контрольным животным (5-я группа) вместо препарата вводили стерильный изотонический раствор натрия хлорида в дозе 0,5 мл.

За животными велись наблюдения в течение 30 сут. после введения препарата и учитывалась их сохранность, общее состояние и внешний вид.

Определение острой токсичности (LD50) препарата при введении его в желудок, было проведено на серых мышах. Десяти мышам (5 самок и 5 самцов) вместе с гранулами давали по 1,0 мл раствора препарата на мышь с концентрацией 0,5 мг/мышь. Препарат скармливали в течение 10 дней, а наблюдение за животными велось в течение 2 недель.

Второй этап исследований токсичности гликопептида выполнен в виварии института на молодняке кроликов 2-месячного возраста.

Для изучения токсичности кролики породы калифорнийская по принципу парных аналогов были разделены на четыре группы по шесть животных в каждой. Первая группа получала ОР, состоящий из 150 г разнотравного сена и 200 г полнорационных гранул. Животные 2-, 3- и 4-й групп дополнительно к ОР в течение 7 дней получали по 1 мл раствора препарата: 2-я группа в количестве 0,8 мг на животное (рекомендуемая доза); 3-я группа – 8 мг (десятикратная доза), 4-я группа – 80 мг/животное (стократная доза).

Опыт продолжался 1,5 месяца. На протяжении всего опыта ежедневно осуществлялся контроль за общим состоянием животных, учитывали потребление ими кормов и проводили взвешивание кроликов и отбор крови до и после скармливания препарата [2].

Местное токсическое действие гликопептидов определяли путём нанесения раствора на кожу [1]. При постановке кожной пробы шерсть на боку выстригали на площади 6α9 см и двукратно с интервалом в 24 ч втирали в кожу раствор препарата, а контрольным животным втирали в кожу воду. Учёт реакции проводили ежедневно в течение 4 суток. До и после нанесения препарата измеряли толщину кожной складки.

Для изучения аллергенных свойств препарата в опыт были взяты те же животные, на которых испытывалось местное токсическое действие на кожу (по 4 кролика из контрольной и опытной групп). Кроликам на один и тот же выстриженный участок кожи наносили путём втирания на протяжении 8 сут. раствор препарата в концентрации 0,8 мг/мл. Через 14 сут. после последней аппликации гликопептида на кожу свежевыстриженного участка спины этим же животным вновь втирали препарат в той же концентрации. Учёт реакции проводили через 24 ч.

Изучение раздражающего действия на конъюнктиву глаза. Для внесения раствора препарата в конъюнктивальный мешок кролику оттягивали верхнее веко и закапывали из пипетки 1–2 капли раствора препарата (без твёрдых частиц), а контрольным кроликам идентично вводили стерильную воду. В каждой группе было по 6 кроликов. Учёт реакции проводили ежедневно в течение 6 сут.

Результаты исследований и обсуждение

В последнее время появился интерес к иммуномодуляторам – гликопептидам как синтетическим, так и натуральным, выделенным из различных молочнокислых бактерий. В 1974 г. F. Lederer, et al. [10] обнаружили, что такие сравнительно небольшие по молекулярной массе соединения, такие как мурамилдипептид (MDP), обладает такими же иммуномодулирующими свойствами, как адьювант Фрейда, что привело к производству новых иммуномодуляторов на его основе.

Одновременно болгарские учёные выделили биологически активные соединения из лизоцимного гидролизата клеток Lactobacillus bulgaricus. Выделенный препарат, названный бластолизин, используется в медицине и обладает противоопухолевыми свойствами. В совместном исследовании болгарских и московских учёных при изучении гликопептида бластолизина установлена его структура [13]. Этот гликопептид представляет собой дисахарид пентапептид, в котором пептидная часть состоит из следующей последовательности аминокислот: L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Asp-D-Ala. Начальная часть молекулы гликопептида установленной структуры представляет собой GMDP. Московскими учёными ИБХ им. Шемякина впервые был синтезирован GMDP, изучены его свойства и установлено, что препарат обладает противоопухолевой активностью аналогичной MDP [11].

Дальнейшие исследования: доклинические испытания, лекарственная форма и масштабирование технологии осуществлены в Латвии Институтом органического синтеза (г. Рига) и НПО «Биолар» (г. Олайне).

В мире были получены два фармацевтических препарата: Ромуртид – аналог MDP, производимый в Японии, и Ликопид – аналог GMDP, производимый в России, а также ветеринарный препарат Гликопин (аналог GMDP) – производитель ЗАО «Пептек» (Россия).

Следует отметить, что средняя смертельная доза (LD50), характеризующая токсичность препарата, равна для MDP (Ромуртид) и GMDP (Ликопид и Гликопин) 25 и 100 мг/кг, соответственно [12, 14].

По нашему мнению, необходимо дальнейшее исследование природных гликопептидов из молочнокислых бактерий, включая их выделение и характеристику свойств. Такие препараты могут быть менее токсичными, более дешевыми и найти широкое применение в качестве добавки для укрепления защитных сил организма как человека, так и животных.

Проведенные исследования показали, что применение гликопептидов молочнокислых бактерий в кормлении мышей и молодняка кроликов во всех использованных дозах (рекомендуемая, десяти- и стократная) не вызывало гибели подопытных животных (табл. 1). Не наблюдалось также каких-либо отклонений в их общем состоянии, внешнем виде, поведении и потреблении корма. Основные параметры крови животных контрольной и опытных групп находились в пределах физиологической нормы, лейкоцитарная формула во всех группах соответствовала лейкограмме здоровых животных.

Изучение раздражающего действия на конъюнктиву глаза и оценка аллергенности.

При определении воздействия гликопептида на слизистые оболочки глаз кроликов каких-либо изменений со стороны конъюнктивы, роговицы и зрачка не обнаружено. Не было гиперемии слизистой, отёчности или гнойных истечений из глаза.

Отсутствовало и местное токсическое действие изучаемого препарата при его нанесении на кожу кроликам. Не было утолщения кожной складки после втирания препарата; болезненность, припухлость, повышение температуры в месте нанесения отсутствовали.

Как показали дальнейшие исследования препарата, то он не проявлял аллергенных свойств: на месте нанесения препарата в соответствии с существующей методикой аллергической реакции в виде инфильтрации, изъязвления, некрозов ткани не наблюдалось.

Заключение

В настоящей работе была изучена безвредность гликопептидов молочнокислых бактерий. Исходя из полученных данных, изучаемый нами препарат не оказывает токсичного, токсигенного и аллергенного действия на организм лабораторных животных, не раздражает неповрежденные слизистые оболочки.

Значения средней смертельной дозы (LD50) для исследуемых природных гликопептидов из различных видов лактобактерий (Lactobacillusbulgaricus, L. Аcidophilus, L. Рlantarum) в эксперименте определить не удалось, в связи с отсутствием гибели животных.

Для синтетических гликопептидов MDP и GMDPLD50 составляет 25 мг/кг и 100 мг/кг, соответственно.

По совокупности полученных данных следует, что ни один из гликопептидов молочнокислых бактерий не токсичен для лабораторных животных, и изучаемый препарат может быть отнесён к четвёртому классу опасности, т. е. является безопасным для животных и человека.