Preview

Фармакокинетика и Фармакодинамика

Расширенный поиск

Разработка и валидация методики количественного определения соединения ГИЖ-298 в плазме крови крыс с использованием ВЭЖХ-УФ

https://doi.org/10.24411/2587-7836-2019-10046

Полный текст:

Аннотация

Разработана методика количественного определения соединения ГИЖ-298 в плазме крови крыс. Анализ проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием. Методика линейна в диапазоне 100-5000 нг/мл. Процент извлечения ГИЖ-298 из плазмы крови составил 86,88 %. Нижний предел обнаружения составил 100 нг/мл.

Для цитирования:


Грибакина О.Г., Шевченко Р.В., Колыванов Г.Б., Литвин А.А., Бочков П.О., Бойко С.С., Жердев В.П. Разработка и валидация методики количественного определения соединения ГИЖ-298 в плазме крови крыс с использованием ВЭЖХ-УФ. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2019;(2):41-45. https://doi.org/10.24411/2587-7836-2019-10046

For citation:


Gribakina O.G., Shevchenko R.V., Kolyvanov G.B., Litvin A.A., Bochkov P.O., Boyko S.S., Zherdev V.P. Development and validation of the quantification of GIZH-298, possessing in the rat blood plasma by HPLC-UF. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2019;(2):41-45. (In Russ.) https://doi.org/10.24411/2587-7836-2019-10046

Введение

Эпилепсия является одним из самых распространённых неврологических заболеваний, по данным ВОЗ, заболеваемость которой в разных странах варьирует от 4 до 10 случаев на 1 000 человек [1]. До настоящего времени в России нет отечественных эффективных противоэпилептических препаратов (ПЭП), почти все препараты этой группы производятся за рубежом и имеют высокую стоимость. В связи с этим поиск новых высокоэффективных и малотоксичных отечественных ПЭП является актуальной задачей [2].

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» синтезировано новое производное оксима 4-бензоилпиридина – ГИЖ-298 (оксалат О-(2-морфолиноэтил)оксим 4-бензоилпиридина). Это соединение обладает противосудорожной активностью, устраняя первично-генерализованные судороги в тестах антагонизма с максимальным электрошоком и коразолом у грызунов в дозах 0,5–100 мг/кг внутрибрюшинно. ЛД50 после внутрибрюшинного введения для соединения ГИЖ-298 составляет 316 мг/кг (мыши). Таким образом, ГИЖ-298 имеет большую терапевтическую широту [3].

Целью настоящего исследования является разработка и валидация методики количественного определения ГИЖ-298 в плазме крови крыс для последующего изучения его экспериментальной фармакокинетики. Материалы и методы

Структурная фомула фармацевтической субстанции ГИЖ-298 (оксалат О-(2-морфолиноэтил)оксима 4-бензоилпиридина) представлена на рис. 1.

Производитель: ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва. Серия – 10.10.18. Использованы следующие растворители и реактивы: вода ультрачистая «LiChrosolv», «Merck», ФРГ; аммония ацетат «Merck», ФРГ; кислота муравьиная 85 % «AcrosOrganics», РФ; метанол «LiChrosolv», «Merck», ФРГ; эфир диэтиловый ОАО «МедХимпром», РФ.

Исследование выполнено на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «BeckmanCoulter» (США). Помпа – «BeckmanSystemGold 127 SolventModule» и ультрафиолетового детектора – «BeckmanGold 166». Детектирование соединения проводили при длине волны 258 нм.

Условия хроматографического анализа ГИЖ-298 представлены в табл. 1.

В настоящей методике матрицей для приготовления калибровочных стандартов служила плазма крови крыс с массой тела 180-220 г, полученных из питомника Филиал «Столбовая» Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», Московская обл. Образцы крови получали методом декапитации интактных животных. Плазму крови получали центрифугированием образцов цельной крови при 3 500 об/мин в течение 10 мин. Образцы плазмы крови крыс хранили при температуре –50 °C.

Пробоподготовка. Для пробоподготовки образцов для анализа использовали метод жидкость-жидкостной экстракции. Образцы плазмы крови, хранящиеся в морозильной камере, размораживали при комнатной температуре. К образцам плазмы крови объёмом 0,5 мл с целевыми концентрациями добавляли 0,1 мл 2 М раствора КОН и перемешивали на механическом вихревом встряхивателе «Vortex». К полученному раствору добавляли 10 мл эфира диэтилового и помещали на горизонтальный встряхиватель на 20 мин. После чего смесь замораживали при –50 °C в течение 15 мин, отделяли органический слой и упаривали в токе азота при 40 °C на водяной бане. Перед началом анализа сухой остаток растворяли в 0,5 мл подвижной фазы.

Приготовление сток-раствора (матричного раствора). Матричный раствор ГИЖ-298 (100 мкг/мл) готовили растворением в метаноле точной навески (0,0100 г) ГИЖ-298 в мерной колбе вместимостью 100 мл.

Приготовление калибровочных стандартов. Использовали калибровочные стандарты ГИЖ-298 с концентрациями 100, 250, 500, 750, 1 000, 2 500 и 5 000 нг/мл.

Калибровочные стандарты для валидации были приготовлены путём последовательного разбавления матричного раствора водой дистиллированной. Диапазон концентраций ГИЖ-298 выбирался исходя из концентраций, ожидаемых в исследовании экспериментальной фармакокинетики.

Концентрации ГИЖ-298 в анализируемых пробах определяли методом абсолютной калибровки.

Результаты и обсуждения

Валидацию методики проводили в соответствии с «Руководством по валидации аналитических методик для производителей лекарств» [4]. В приведённых выше условиях время удерживания ГИЖ-298 в среднем составило около 8,0 мин (рис. 2б).

Селективность. Для определения селективности были протестированы 6 образцов биологической матрицы (плазма крови) на возможность создания помех потенциально мешающими веществами (эндогенные компоненты плазмы крови, метаболиты, продукты деструкции и др.).

На рис. 2 представлены типичные хроматограммы интактной плазмы крови крыс (а) и экстракта плазмы крови, содержащего 100 нг/мл ГИЖ-298 (б). Из рис. 2 видно, что потенциально мешающие вещества не оказывают влияния на анализ ГИЖ-298.

Линейность и чувствительность. Калибровочная кривая построена с использованием 7 калибровочных стандартов, охватывающих ожидаемый диапазон концентраций ГИЖ-298 в плазме крови крыс (100– 5 000 нг/мл).

Самый низкий стандарт на калибровочной кривой соединения ГИЖ-298, равный 100 нг/мл, был принят в качестве предела количественного определения, т. к. были выполнены следующие условия:

•         Показания стандарта на нижнем пределе количественного определения (НПКО) были не менее чем в 5 раз выше показаний пробы интактной плазмы крови. Значение стандарта на уровне НПКО поддавались определению и были дискретными и воспроизводимыми с точностью 14,76 % (не превышающей 20 %), и воспроизводимостью 99,16 % (входящей в диапазон 80–120 %).

•         Предел обнаружения ГИЖ-298 был равен 100 нг/мл.

•         Зависимость величины хроматографического пика от концентрации ГИЖ-298 калибровочных стандартов в области измерения методики была линейной в рассматриваемом диапазоне концентраций.

Для описания изучаемой зависимости использовалась линейная аппроксимация типа y = a + bα× x. Данная зависимость признана приемлемой, поскольку коэффициент корреляции для всех 3 калибровок был выше 0,99.

Параметры калибровочных кривых (коэффициенты уравнения и коэффициенты корреляции) представлены в табл. 2.

Для оценки прецизионности результатов построены 3 калибровочные кривые и проведён обратный расчёт концентраций используемых стандартов по всем кривым и определены статистические характеристики.

Прецизионность результатов с учётом критериев приемлемости достигается во всем используемом интервале концентраций (табл. 3).

Критерии приемлемости по калибровочным стандартам:

1.       Отклонения нижнего стандарта кривой от теоретической концентрации не более 20 %;

2.       Отклонения всех остальных стандартов не более 15 %;

3.       Не менее 75 % ненулевых стандартов, включая нижний и верхний калибровочный стандарт должны удовлетворять вышеуказанным требованиям; все значения, которые не попадают в эти пределы, можно не учитывать, при условии, что они не изменяют установленную линейную модель.

Как видно из данных табл. 3 отклонения нижнего стандарта кривой от теоретической концентрации составило 0,84 %, т. е. менее 20 %. Отклонения всех остальных стандартов были менее 15 %, что также удовлетворяет критериям приемлемости.

Правильность и воспроизводимость внутри одной аналитической серии

Правильность и воспроизводимость внутри одной аналитической серии оценивались по результатам параллельных анализов образцов контроля качества (КК) с концентрациями ГИЖ-298: 100, 250, 1 000 и 2 500 нг/мл. Каждый образец КК определялся в 6 повторностях. Расчёт концентраций образцов КК проводился по калибровочной кривой, полученной в составе той же аналитической серии. Данные по правильности и достоверности определения соединения ГИЖ-298 в плазме крови крыс внутри одной серии представлены в табл. 4 и удовлетворяли следующим критериям приемлемости: воспроизводимость – среднее значение концентрации образца КК не должно превышать 15 % от теоретической величины, за исключением значения на уровне нижнего количественного предела, где допускается отклонение не выше 20 %; правильность – C.V. % значений концентраций каждого образца КК не должен превышать 15 %, за исключением значений НПКО, где этот параметр не должен быть выше 20 % [4].

Степень извлечения

Степень извлечения ГИЖ-298 из плазмы крови определялась путём сравнения площадей хроматографических пиков образцов КК (принимались за 100 %) с площадями пиков тех же проб, которые подвергались процедуре пробоподготовки. Измерения каждого уровня концентрации стандартов (низкий – 100, средний – 1 000 и высокий – 5 000 нг/мл) проводили в трёх повторениях. Установлено, что процент извлечения ГИЖ-298 из плазмы крови составил 86,88 %.

Стабильность препарата после пробоподготовки

Для оценки стабильности ГИЖ-298 в плазме крови использовались образцы ГИЖ-298 250 и 1 000 нг/мл, которые хранились при комнатной температуре и дневном свете после пробоподготовки в течение 8 ч. Далее проводили анализ образцов вместе со свежеприготовленными образцами в составе одной аналитической серии. Рассчитанные концентрации ГИЖ-298 после хранения при комнатной температуре сравнивали со средними значениями концентраций препарата в свежеприготовленных образцах КК. Полученные значения должны были удовлетворять критерию приемлемости, т. е. разница между результатами анализа до и после хранения не должна превышать 15 %.

Из данных табл. 5 следует, что концентрации ГИЖ298 после хранения при комнатной температуре в течение 8 ч удовлетворяют критерию приемлемости.

Заключение

Проведена валидация аналитической методики количественного определения ГИЖ-298 в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием. Нижний предел количественного определения ГИЖ-298 составил 100 нг/мл. Точность и прецизионность результатов анализа с учётом критериев приемлемости соблюдались во всем интервале исследуемых концентраций (100–5 000 нг/мл). При комнатной температуре пробы стабильны после пробоподготовки на протяжении 8 ч. Образцы плазмы крови можно разводить в два раза.

Список литературы

1. Who.int [internet]. World Health Organization. Режимдоступа: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/.

2. Гайдуков Игорь Олегович. Поиск веществ с противосудорожной активностью среди производных оксимов 3- и 4-бензоилпиридина: автореферат дисс. канд. биол. наук: 14.03.06/ Гайдуков Игорь Олегович. – М.: 2018. – 23 с. [Gajdukov IO. The search for compounds with the anticonvulsant activity of derivatives of oximes 3- and 4-benzoylpyridine. Autoabstract diss. candidate of biological sciences: 14.03.06/ Gajdukov Igor Olegovich. Moscow: 2018. (In Russ).].

3. Жмуренко Л.А, Мокров Г.В., Неробкова Н.Л., и др. Новое производное оксимов 4-бензоилпиридинов ГИЖ-298, обладающее противосудорожной активность // Фармакокинетика и фармакодинамика. – 2017. – № 1. – С. 22–26. [Zhmurenko LA, Mokrov GV, Nerobkova NL, et al. Novel 4- benzoylpyridine oxime derivative GIZH-298 with aticonvuisant activity. Farmakokinetika i Farmakodinamika. 2017;1:22–26. (In Russ).].

4. Валидация аналитических методик для производителей лекарств. Типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств / под ред. В.В. Береговых – М.: Литтерра, 2008. – 132 с. [Validaciya analiticheskih metodik dlya proizvoditelej lekarstv. Ed. By VV Beregovyh. Moscow: Litterra. 2008. (In Russ).].


Об авторах

Оксана Геннадьевна Грибакина
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»
Россия


Роман Владимирович Шевченко
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»
Россия


Геннадий Борисович Колыванов
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»
Россия


Александр Алексеевич Литвин
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»
Россия


Павел Олегович Бочков
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»
Россия


Светлана Семёновна Бойко
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»
Россия


Вдадимир Павлович Жердев
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»
Россия


Для цитирования:


Грибакина О.Г., Шевченко Р.В., Колыванов Г.Б., Литвин А.А., Бочков П.О., Бойко С.С., Жердев В.П. Разработка и валидация методики количественного определения соединения ГИЖ-298 в плазме крови крыс с использованием ВЭЖХ-УФ. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2019;(2):41-45. https://doi.org/10.24411/2587-7836-2019-10046

For citation:


Gribakina O.G., Shevchenko R.V., Kolyvanov G.B., Litvin A.A., Bochkov P.O., Boyko S.S., Zherdev V.P. Development and validation of the quantification of GIZH-298, possessing in the rat blood plasma by HPLC-UF. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2019;(2):41-45. (In Russ.) https://doi.org/10.24411/2587-7836-2019-10046

Просмотров: 45


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2587-7836 (Print)
ISSN 2686-8830 (Online)