Введение

Эпилепсия является одним из самых распространённых неврологических заболеваний, по данным ВОЗ, заболеваемость которой в разных странах варьирует от 4 до 10 случаев на 1 000 человек [1]. До настоящего времени в России нет отечественных эффективных противоэпилептических препаратов (ПЭП), почти все препараты этой группы производятся за рубежом и имеют высокую стоимость. В связи с этим поиск новых высокоэффективных и малотоксичных отечественных ПЭП является актуальной задачей [2].

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» синтезировано новое производное оксима 4-бензоилпиридина – ГИЖ-298 (оксалат О-(2-морфолиноэтил)оксим 4-бензоилпиридина). Это соединение обладает противосудорожной активностью, устраняя первично-генерализованные судороги в тестах антагонизма с максимальным электрошоком и коразолом у грызунов в дозах 0,5–100 мг/кг внутрибрюшинно. ЛД50 после внутрибрюшинного введения для соединения ГИЖ-298 составляет 316 мг/кг (мыши). Таким образом, ГИЖ-298 имеет большую терапевтическую широту [3].

Целью настоящего исследования является разработка и валидация методики количественного определения ГИЖ-298 в плазме крови крыс для последующего изучения его экспериментальной фармакокинетики. Материалы и методы

Структурная фомула фармацевтической субстанции ГИЖ-298 (оксалат О-(2-морфолиноэтил)оксима 4-бензоилпиридина) представлена на рис. 1.

Производитель: ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва. Серия – 10.10.18. Использованы следующие растворители и реактивы: вода ультрачистая «LiChrosolv», «Merck», ФРГ; аммония ацетат «Merck», ФРГ; кислота муравьиная 85 % «AcrosOrganics», РФ; метанол «LiChrosolv», «Merck», ФРГ; эфир диэтиловый ОАО «МедХимпром», РФ.

Исследование выполнено на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «BeckmanCoulter» (США). Помпа – «BeckmanSystemGold 127 SolventModule» и ультрафиолетового детектора – «BeckmanGold 166». Детектирование соединения проводили при длине волны 258 нм.

Условия хроматографического анализа ГИЖ-298 представлены в табл. 1.

В настоящей методике матрицей для приготовления калибровочных стандартов служила плазма крови крыс с массой тела 180-220 г, полученных из питомника Филиал «Столбовая» Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», Московская обл. Образцы крови получали методом декапитации интактных животных. Плазму крови получали центрифугированием образцов цельной крови при 3 500 об/мин в течение 10 мин. Образцы плазмы крови крыс хранили при температуре –50 °C.

Пробоподготовка. Для пробоподготовки образцов для анализа использовали метод жидкость-жидкостной экстракции. Образцы плазмы крови, хранящиеся в морозильной камере, размораживали при комнатной температуре. К образцам плазмы крови объёмом 0,5 мл с целевыми концентрациями добавляли 0,1 мл 2 М раствора КОН и перемешивали на механическом вихревом встряхивателе «Vortex». К полученному раствору добавляли 10 мл эфира диэтилового и помещали на горизонтальный встряхиватель на 20 мин. После чего смесь замораживали при –50 °C в течение 15 мин, отделяли органический слой и упаривали в токе азота при 40 °C на водяной бане. Перед началом анализа сухой остаток растворяли в 0,5 мл подвижной фазы.

Приготовление сток-раствора (матричного раствора). Матричный раствор ГИЖ-298 (100 мкг/мл) готовили растворением в метаноле точной навески (0,0100 г) ГИЖ-298 в мерной колбе вместимостью 100 мл.

Приготовление калибровочных стандартов. Использовали калибровочные стандарты ГИЖ-298 с концентрациями 100, 250, 500, 750, 1 000, 2 500 и 5 000 нг/мл.

Калибровочные стандарты для валидации были приготовлены путём последовательного разбавления матричного раствора водой дистиллированной. Диапазон концентраций ГИЖ-298 выбирался исходя из концентраций, ожидаемых в исследовании экспериментальной фармакокинетики.

Концентрации ГИЖ-298 в анализируемых пробах определяли методом абсолютной калибровки.

Результаты и обсуждения

Валидацию методики проводили в соответствии с «Руководством по валидации аналитических методик для производителей лекарств» [4]. В приведённых выше условиях время удерживания ГИЖ-298 в среднем составило около 8,0 мин (рис. 2б).

Селективность. Для определения селективности были протестированы 6 образцов биологической матрицы (плазма крови) на возможность создания помех потенциально мешающими веществами (эндогенные компоненты плазмы крови, метаболиты, продукты деструкции и др.).

На рис. 2 представлены типичные хроматограммы интактной плазмы крови крыс (а) и экстракта плазмы крови, содержащего 100 нг/мл ГИЖ-298 (б). Из рис. 2 видно, что потенциально мешающие вещества не оказывают влияния на анализ ГИЖ-298.

Линейность и чувствительность. Калибровочная кривая построена с использованием 7 калибровочных стандартов, охватывающих ожидаемый диапазон концентраций ГИЖ-298 в плазме крови крыс (100– 5 000 нг/мл).

Самый низкий стандарт на калибровочной кривой соединения ГИЖ-298, равный 100 нг/мл, был принят в качестве предела количественного определения, т. к. были выполнены следующие условия:

•         Показания стандарта на нижнем пределе количественного определения (НПКО) были не менее чем в 5 раз выше показаний пробы интактной плазмы крови. Значение стандарта на уровне НПКО поддавались определению и были дискретными и воспроизводимыми с точностью 14,76 % (не превышающей 20 %), и воспроизводимостью 99,16 % (входящей в диапазон 80–120 %).

•         Предел обнаружения ГИЖ-298 был равен 100 нг/мл.

•         Зависимость величины хроматографического пика от концентрации ГИЖ-298 калибровочных стандартов в области измерения методики была линейной в рассматриваемом диапазоне концентраций.

Для описания изучаемой зависимости использовалась линейная аппроксимация типа y = a + bα× x. Данная зависимость признана приемлемой, поскольку коэффициент корреляции для всех 3 калибровок был выше 0,99.

Параметры калибровочных кривых (коэффициенты уравнения и коэффициенты корреляции) представлены в табл. 2.

Для оценки прецизионности результатов построены 3 калибровочные кривые и проведён обратный расчёт концентраций используемых стандартов по всем кривым и определены статистические характеристики.

Прецизионность результатов с учётом критериев приемлемости достигается во всем используемом интервале концентраций (табл. 3).

Критерии приемлемости по калибровочным стандартам:

1.       Отклонения нижнего стандарта кривой от теоретической концентрации не более 20 %;

2.       Отклонения всех остальных стандартов не более 15 %;

3.       Не менее 75 % ненулевых стандартов, включая нижний и верхний калибровочный стандарт должны удовлетворять вышеуказанным требованиям; все значения, которые не попадают в эти пределы, можно не учитывать, при условии, что они не изменяют установленную линейную модель.

Как видно из данных табл. 3 отклонения нижнего стандарта кривой от теоретической концентрации составило 0,84 %, т. е. менее 20 %. Отклонения всех остальных стандартов были менее 15 %, что также удовлетворяет критериям приемлемости.

Правильность и воспроизводимость внутри одной аналитической серии

Правильность и воспроизводимость внутри одной аналитической серии оценивались по результатам параллельных анализов образцов контроля качества (КК) с концентрациями ГИЖ-298: 100, 250, 1 000 и 2 500 нг/мл. Каждый образец КК определялся в 6 повторностях. Расчёт концентраций образцов КК проводился по калибровочной кривой, полученной в составе той же аналитической серии. Данные по правильности и достоверности определения соединения ГИЖ-298 в плазме крови крыс внутри одной серии представлены в табл. 4 и удовлетворяли следующим критериям приемлемости: воспроизводимость – среднее значение концентрации образца КК не должно превышать 15 % от теоретической величины, за исключением значения на уровне нижнего количественного предела, где допускается отклонение не выше 20 %; правильность – C.V. % значений концентраций каждого образца КК не должен превышать 15 %, за исключением значений НПКО, где этот параметр не должен быть выше 20 % [4].

Степень извлечения

Степень извлечения ГИЖ-298 из плазмы крови определялась путём сравнения площадей хроматографических пиков образцов КК (принимались за 100 %) с площадями пиков тех же проб, которые подвергались процедуре пробоподготовки. Измерения каждого уровня концентрации стандартов (низкий – 100, средний – 1 000 и высокий – 5 000 нг/мл) проводили в трёх повторениях. Установлено, что процент извлечения ГИЖ-298 из плазмы крови составил 86,88 %.

Стабильность препарата после пробоподготовки

Для оценки стабильности ГИЖ-298 в плазме крови использовались образцы ГИЖ-298 250 и 1 000 нг/мл, которые хранились при комнатной температуре и дневном свете после пробоподготовки в течение 8 ч. Далее проводили анализ образцов вместе со свежеприготовленными образцами в составе одной аналитической серии. Рассчитанные концентрации ГИЖ-298 после хранения при комнатной температуре сравнивали со средними значениями концентраций препарата в свежеприготовленных образцах КК. Полученные значения должны были удовлетворять критерию приемлемости, т. е. разница между результатами анализа до и после хранения не должна превышать 15 %.

Из данных табл. 5 следует, что концентрации ГИЖ298 после хранения при комнатной температуре в течение 8 ч удовлетворяют критерию приемлемости.

Заключение

Проведена валидация аналитической методики количественного определения ГИЖ-298 в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием. Нижний предел количественного определения ГИЖ-298 составил 100 нг/мл. Точность и прецизионность результатов анализа с учётом критериев приемлемости соблюдались во всем интервале исследуемых концентраций (100–5 000 нг/мл). При комнатной температуре пробы стабильны после пробоподготовки на протяжении 8 ч. Образцы плазмы крови можно разводить в два раза.