Исследование фармакокинетики противотуберкулезного препарата Биомайрин

Введение

Туберкулез лёгких в настоящее время остаётся одной из главных проблем здравоохранения во всем мире, от него ежегодно умирают около трёх миллионов человек [1, 2]. В комплексной терапии туберкулёза наиболее часто используют такие препараты, как изониазид, этамбутол и рифампицин. Они обладают хорошей эффективностью, но оказывают значительное токсическое воздействие на организм. Сложившаяся ситуация вынуждает искать новые подходы к лечению туберкулёза. Для снижения токсичности лекарственных средств ведётся разработка низкодозных лекарственных препаратов, основанных на использовании метода молекулярного конструирования с природными полимерами [3, 4], каковыми являются полисахариды и их производные, такие как полигалактуроновая кислота. В отличие от синтетических полимеров они не проявляют побочных токсических эффектов. Созданные таким путём лекарственные композиции имеют существенно меньшую терапевтическую дозу активно действующей субстанции и, следовательно, они менее токсичны. Полимерные терапевтические системы позволяют дозировать поступление лекарственного вещества, пролонгировать его действие, предохраняя лекарственное вещество от преждевременного разрушения, а также в значительной степени избегать побочного эффекта (высокой токсичности) [5, 6].

Целью исследования является изучение фармакокинетики противотуберкулёзного препарата Биомайрин, полученного путём химического связывания противотуберкулёзных препаратов изониазида, этамбутола и рифампицина посредством химической связи.

Химическую структуру Биомайрина можно представить как комплексы полигалактуроновой кислоты с гидрозона4-пиридинкарбоновой кислотой и [S-(R*,R*)]2,2'-(1,2-этандиилдиимино)бис(1-бутанола) и полигалактуроновой кислоты с 3-[[(4-метил-1-пиперазинил) имино]метил] рифампицином:

Биомайрин

Материалы и методы исследования

Изучение фармакокинетики препарата Биомайрин проводили на беспородных белых крысах самцах массой тела 180–200 г. Контрольная группа – 3 особи. На каждую временную точку по 5 крыс. 3 крысы были посажены в метаболические камеры для отбора образцов мочи.

Капсулу Биомайрина вскрывали и содержимое капсулы (600 мг) растворяли в 200 мл дистиллированной воды, перемешивали. Испытуемый препарат опытным животным вводили перорально однократно по 1 мл специальным зондом в дозе 15 мг/кг или 3 мг на крысу. Итого этамбутола 450 мкг на одну крысу, изониазида 450 мкг, рифампицина 510 мкг.

Для сравнения была составлена механическая смесь из трёх препаратов рифампицина, этамбутола и изониазида (препарат сравнения) без полимера с таким же количественным составом. Препарат сравнения 282 мг растворяли в 200 мл дистиллированной воды и вводили опытным животным перорально однократно по 1 мл специальным зондом, в дозе 7,05 мг/кг или 1,41 мг на крысу. Итого этамбутола 450 мкг на одну крысу, изониазида 450 мкг, рифампицина 510 мкг.

Через 30 минут, 1, 2, 3, 5, 24, 48, 54, 72, 96 часов после введения препарата животных декапитировали под эфирным наркозом, отбирали кровь и органы (легкие, почки и печень). Мочу собирали через 6, 24, 30, 48, 72, 96, 120 часов, 6 и 7 дней после введения препарата. Органы взвешивали (табл. 1) и лиофильно высушивали. Высушенные органы тщательно измельчали, делили пополам на 2 равные части.

Кровь выдерживали в течение часа при комнатной температуре и центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин. Отбирали супернатант. Мочу собирали, измеряли объем (табл. 2).

Этамбутол и изониазид экстрагировали из органов водой 1:2 из печени и 1:3 из лёгких и почек (m/v).   В экстрактах осаждали белки 0,3 М трихлоруксусной кислотой (1:1 по v/v). Экстракты центрифугировали 20 мин при 3000 об./мин. Кровь отбирали по 1 мл и осаждали белки 0,3 М трихлоруксусной кислотой (1:1 по v/v), центрифугировали 20 мин при 3000 об./мин. Из второй половины высушенных органов экстрагировали рифампицин смесью хлороформ:этанол (4:1) в соотношении 1:5 (m/v). Такой же смесью хлороформ:этанол (4:1 v/v) экстрагировали рифампицин из 1 мл крови и мочи опытных животных в соотношении 1:5 (m/v). Центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об./мин, отбирали супернатант и упаривали в токе воздуха.

Для определения количественного содержания рифампицина и изониазида образцы анализировали методом ВЭЖХ. Условия ВЭЖХ: хроматограф Agilent Technologies 1200 с DAD детектором и автоматическим пробоотборником. Колонка: 4,6  150мм EclipseXDBC 18,5 µm. Подвижная фаза: А:0,05М СН3СООNa*3H2O pH = 6, В: CH3CN. Скорость потока — 1 мл/мин. Градиент %, в мин: 0 % — 0–4мин; 60 % — 7 мин; 60 % — 12 мин; 0 % — 15 мин. Поглощение при 266 нм. Продолжительность анализа – 15 мин. Этамбутол в образцах сыворотки крови, мочи и органах определяли спектрофотометрическим методом [7]. Определение основано на взаимодействии этамбутола с роданидом ртути в кислой среде с образованием окрашенного в красно-оранжевый цвет продукта реакции. Измерение оптической плотности проводили при длине волны 457 нм. Готовили растворы железоаммонийных квасцов и роданистой ртути. 30,5 г железоаммонийных квасцов вносили в коническую колбу, добавляли 50 мл дистиллированной воды и 155 мл концентрированной азотной кислоты. Раствор фильтровали через воронку в мерную колбу вместимостью 250 мл, и доводили водой до 250 мл. Раствор хранят в холодильнике в течение месяца. Ртуть роданистую (0,3 % спиртовой раствор) в количестве 0,30 г растворяли в 99,7 мл 95 % этилового спирта. Спустя сутки раствор пропускали через фильтр «белая лента» в мерную колбу вместимостью 100 мл. Раствор устойчив в течение двух недель. Хранят в холодильнике. 154 мкл исследуемого раствора смешивали с 38 мкл раствора железоаммонийных квасцов, перемешивали и оставляли на 5 минут. Затем вносили 8 мкл раствора роданистой ртути и через 10 минут измеряли оптическую плотность при длине волны 457 нм.

Результаты и обсуждение

После однократного перорального введения препарата сравнения в дозе 7,5 мг/кг белым крысам препарат изониазид быстро всасывается, достигая максимальной концентрации (5,18 ± 0,54) в крови через 1 час, а в лёгких через 3 часа, и сохраняется в бактериостатических пределах в течение 12 часов (рис. 1). Терапевтическая доза изониазида составляет 1,5 мкг/мл через 3 часа после перорального введения препарата сравнения. Бактериостатическая активность изониазида составляет 0,03 мкг/мл. Препарат проникает во все физиологические жидкости – спинномозговую жидкость, плевральную, асцитическую, молоко у кормящих матерей, притом уровень его концентрации в этих жидкостях похож на его уровень в плазме [8]. При однократном пероральном введении Биомайрина в дозе 15 мг/кг изониазид проявляется в крови крыс уже через 60 минут в концентрации (4,68 ± 0,57 мкг/мл), и далее концентрация изониазида сохраняется в интервале 3,0–6,0 мкг/мл в течение 48 часов. Затем идёт плавное снижение концентрации препарата в крови до 72 часов после введения (см. рис. 1).

Аналогичное изменение концентрации изониазида наблюдалось в печени, где максимальная концентрация (38,3 мкг/на орган) проявилась через 2 часа. Исследования показали, что кинетика выведения изониазида носит двухфазный характер, происходит связывание его с рецепторами в печени и почках, а затем обратное поступление в кровь.

Максимальная концентрация изониазида в лёгких (17,96 ± 2,05 на орган) наблюдается уже через 30 минут после введения Биомайрина, и сохраняется в интервале 6,0–9,0 мкг/мл в течение 54 часов.

Изониазид выделяется преимущественно почками. Несвязанный изониазид фильтруется в клубочках, а связанный с белками сыворотки крови выделяется в канальцах. После однократной терапевтической дозы изониазида в моче определяется через 72 ч.

Как было сказано, изониазид главным образом метаболизируется в печени до ацетилизониазида с помощью ариламин N-ацетилтрансферазы второго типа (NAT2). Ацетилизониазид не проявляет противотуберкулёзную активность. Ацетилизониазид в дальнейшем гидролизуется до изоникотиновой кислоты и ацетилгидразина, оба экскретируются с мочой.

Ацетилизониазид бактериостатически не активен. Изониазид, вступивший в связь с белками крови, также утрачивает бактериостатическую активность. При гидролизе образуется гидразин, который в последующем окисляется до аммиака. Последний является причиной токсического действия изониазида. С мочой в неизмененном виде ежедневно выделяется от 10 до 50 % принятой дозы, остальная часть препарата биотрансформируется и выделяется с мочой в виде метаболитов. Далее были проведены исследования судьбы изониазида в организме после введения препарата сравнения и Биомайрина. На рис. 2 приведена динамика количественного содержания ацетилизониазида в сыворотке крови через определённые промежутки времени после перорального введения препарата сравнения и Биомайрина.

Как видно из рисунка, при введении Биомайрина концентрация ацетилизониазида становится меньше по сравнению с концентрацией ацетилизониазида, образованного при введении препарата сравнения. Вероятно, это связано тем, что при всасывании через энцефалитический барьер некоторая часть Биомайрина переходит в виде полимерного комплекса, где первичная аминогруппа изониазида блокирована (химически связана) с молекулой полигалактуроновой кислоты, что препятствует образованию ацетилизониазида.

После однократного перорального введения препарата сравнения в дозе в 7,5 мг/кг этамбутол быстро всасывается, и через 2 часа достигается максимальная концентрация в сыворотке до 6 мкг/мл, через 24 часа её концентрация снижается и составляет менее чем 1 мкг/мл. В организме 20-30 % этамбутола связывается с белками плазмы. Следует отметить, что особенностью фармакокинетики этамбутола является то, что он избирательно накапливается в эритроцитах (в 2 раза выше, чем концентрация в плазме крови).

ЭБ метаболизируется в печени до производных дикарбоксиловой кислоты. Хорошо проникает в различные органы и биологические жидкости. Наибольшая концентрация наблюдается в почках, лёгких, слюне и моче. Период полувыведения составляет 3–4 часа, а при почечной недостаточности удлиняется до 8 часов. В течение 24 часов более 50 % дозы лекарства выделяется с мочой в неизмененном виде, а 8–15 % в виде неактивных метаболитов. Около 20–22 % начальной дозы препарата выделяется с калом в неизмененном виде.

При введении Биомайрина максимальная концентрация этамбутола (5,93 мкг/мл) в крови наблюдается через 3 часа после введения. В дальнейшем уровень этамбутола в крови плавно снижается к 72 часам (рис. 3).

Относительно высокий уровень этамбутола в печени через 2 часа после введения препарата коррелирует с максимальным уровнем этамбутола в крови. В лёгких максимум концентрации этамбутола достигает через 3 часа после введения препарата. Этамбутол выводится с мочой (50 %) в течение 78 часов.

При однократном пероральном введении препарата сравнения быстро и полно всасывается в желудочно-кишечном тракте. Максимальная концентрация рифампицина (6,3 мкг/мл) в плазме крови достигается через 2–2,5 часа после приёма внутрь (рис. 4).

Рифампицин обнаруживается в терапевтических концентрациях в плевральном экссудате, мокроте, содержимом каверн, костной ткани; наибольшая концентрация создается в печени и почках. Связывание с белками плазмы крови составляет 80–90 %. Рифампицин проникает через гематоэнцефалический барьер, плаценту, обнаруживается в грудном молоке. Биотрансформируется в печени. Период полувыведения – 2–5 часов. На терапевтическом уровне концентрация препарата поддерживается в течение 8–12 часов после приёма, в отношении высокочувствительных возбудителей в течение 24 ч. Выводится из организма с желчью, калом и мочой.

Максимальная концентрация рифампицина (5,04 мг) в крови, после однократного перорального введения Биомайрина, наблюдается через 5 часов и снижается к 48 часам (см. рис. 4).

Уровень рифампицина в крови и органах довольно низкий, что, по-видимому, связано с его быстрым метаболизмом.

На основе полученных данных по количеству изониазида, этамбутола и рифампицина в сыворотке крови крыс проведены расчёты фармакокинетических параметров в программе Borgia [9]. Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, при введении Биомайрина период полувыведения увеличивается для всех трёх препаратов изониазида, этамбутола и рифампицина. Скорость элиминации уменьшается. Увеличивается период полуабсорбции, уменьшается скорость абсорбции. Для этамбутола не меняется равновесная максимальная концентрация, для изониазида и его модифицированных форм равновесная максимальная концентрация уменьшается на 75 %, а для рифампицина и его модифицированной формы равновесная максимальная концентрация уменьшается на 92 %.

Общий клиренс у Биомайрина для изониазида увеличивается на 250 %, а для этамбутола увеличивается на 320 % и для рифампицина на 615 %. Подобная разница в величине клиренса связана с большей биодоступностью препаратов в составе Биомайрина.

Выводы

Таким образом, результаты фармакокинетических исследований показали, что в составе Биомайрина период полувыведения увеличивается для всех трёх препаратов: изониазид в четыре раза, этамбутол и рифампицин в три раза по сравнению с исходными препаратами, тем самым проявляется пролонгированный эффект. Следует также отметить, что введение изониазида в полисахаридную матрицу замедляет его метаболизм в терапевтически неактивный ацетилизониазид.