Влияние ноотропных препаратов на 5-НТ_2А-рецепторы стриатума аутбредных мышей с различной эффективностью исследовательского поведения

Введение

Cеротонинергическая система осуществляет в мозге модулирующее влияние на большинство основных функций центральной нервной системы, включая память, мышление, эмоции, восприятие, настроение и сознание [1–4]. В осуществлении этих процессов задействовано множество взаимодействующих друг с другом нейромедиаторных систем мозга. В частности, существуют точки зрения о зависимости процессов памяти от баланса активностей серотонини дофаминергической систем мозга [5, 6], серотониновой и глутаматергической [7]. Из 14 подтипов серотониновых рецепторов отдельный интерес для фармакологии интегративных функций представляют 5-НТ2А-рецепторы [8]. Обладая возбуждающим действием, эти рецепторы способны усиливать выброс глутамата, обеспечивая его взаимодействие (модулирующее действие) с различными типами глутаматных рецепторов (АМРА, mGluR2/3, mGluR5) [9]. С другой стороны, в ранее проведённых нами экспериментах с ноотропны ми препаратами, обладающими прокогнитивными свойствами, на фенотипических и генотипических моделях дефицита исследовательской активности в крестообразном лабиринте [10, 11] было показано, что все они проявляют своё избирательное модулирующее действие на н-холинои NMDA-рецепторы в префронтальной коре и гиппокампе животных с исходным дефицитом исследовательской активности [12–15]. Вместе с тем известно, что определённую роль в осуществлении процессов обучения и памяти играют базальные ядра мозга – хвостатое ядро, скорлупа, бледный шар, субталамическое ядро, чёрная субстанция, обладающие отдельными нейронными связями с зонами коры мозга [16]. Однако роль 5-HT2A-рецепторов стриатума в механизме формирования ноотропного эффекта оставалась неизученной.

Таким образом, в предпринятом исследовании предполагалось: (а) сравнить вклад 5-НТ2А-рецепторов в стриатуме в активность исследовательского поведения типированных по эффективности поведения в крестообразном лабиринте мышей 1CR; и (б) оценить на них влияние отечественных ноотропов пантокальцина, семакса и нооглютила в сравнении с пирацетамом.

Материалы и методы

Животные. Исследования проводили на 75 самцах мышей аутбредной линии 1CR (питомник Филиал "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России) массой 30-35 г. Содержание животных соответствовало действующим санитарным правилам по содержанию лабораторных животных. Использовался полный рацион экструдированного брикетированного корма (ГОСТ на корм Р 50258-92). Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351.000.3-96 и 51000.4-96), Приказу МЗ и СР РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики» [17]. Эксперименты проводили с 10 до 16 часов. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Препараты и дозы. Пирацетам – 200 мг/кг/ день (UCB); пантокальцин – 200 мг/кг/день (ФГУП СКТБ «Технолог»); семакс – 0,6 мг/кг/день (ОХФАВ ИМГ РАН), нооглютил – 50 мг/кг/день (Отдел химии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»). Препараты были использованы в дозах, эквипотенциальных по антиамнестическому эффекту, согласно результатам ранее проведённых экспериментов в тестах УРПИ [11].

Тест исследовательского поведения в закрытом крестообразном лабиринте. Оценку ноотропной активности пирацетама, нооглютила, семакса и пантокальцина осуществляли на мышах по тесту спонтанной ориентации (поведения патрулирования) в крестообразном лабиринте, который позволяет одновременно выявлять признаки ноотропного, анксиолитического, седативного, психостимулирующего действия веществ [10, 12]. С помощью теста мышей аутбредной линии 1CR разделяли на две субпопуляции с высокой (ВЭИП) и низкой (НЭИП) исследовательской активностью. Далее типированных животных случайным образом разделяли на группы, получавшие исследуемые препараты. Инъекции проводили в/б ежедневно в течение 5 дней. По истечении этого срока животных повторно тестировали в крестообразном лабиринте, через 24 часа после последней инъекции декапитировали, выделяли стриатумы, которые размещали по группам в криопробирки и хранили в жидком азоте для последующего радиолигандного анализа. Подробное описание метода и результатов поведенческих тестов описано в наших ранних работах [13, 15].

Радиолигандное связывание

Приготовление мембранного материала. Через 24 часа после последней инъекции животных подвергали цервикальной дислокации и декапитации, быстро извлекали мозг на лёд. Стриатумы после выделения замораживали в жидком азоте.

В дальнейшем структуры размораживали и гомогенизировали в отмывочном буфере (50 мМ TrisHCl, рН 7,4). Полученный гомогенат разбавляли 50 объёмами отмывочного ледяного (0-40 °С) и центрифугировали при 40 000 об/мин в течение 20 мин. Полученный супернатант сливали, осадок ресуспендировали в том же объёме отмывочного буфера и повторно центрифугировали. Процедуру отмывки проводили трижды, полученный конечный осадок ресуспендировали в 10 мл инкубационного буфера.

Радиолигандный анализ 5-HT2А-рецепторов. В эксперименте использовали меченный тритием (+)Кетансерин (“PerkinElmer”) с удельной активностью 40 Кюри/ммоль. Реакционная смесь (конечный объём 0,5 мл) содержала 200 мкл инкубационного буфера (Tris-base – 6,050 г, NaCl – 6,955 г, KCl – 0,369 г, CaCl2 – 0,293 г, MgCl2 – 0,202 г, паргилин –2 мг, аскорбиновая кислота – 1 г, pH = 7,4), 50 мкл меченного лиганда (в диапазоне концентраций от 0,1 до 30 нМ) и 250 мкл суспензии белка мембран. Неспецифическое связывание оценивали в присутствии 50 мкл немеченого лиганда (+) Кетансерина (1μМ), которое составляло 12-14 % общего. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при непрерывном встряхивании в шейкере. По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman), предварительно смоченные в 0,3 % полиэтиленимине в течение 2 часов при 40 °С. Каждую пробирку промывали один раз холодным буфером, затем фильтры промывали три раза тем же объёмом буфера. Фильтры просушивали на воздухе и переносили в сцинтилляционные флаконы. Фильтры заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости на основе толуола (4 г PPO, 0,2 г POPOP на 1 л толуола). Радиоактивность определяли на счетчике Tri-Carb 2900TR (“PerkinElmer”) с эффективностью счёта 45-50 %. Для обработки результатов радиолигандного связывания использовали программу GraphPadPrism 4 Demo. Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась с помощью программы Statistica 6.0 (“StatSoft”, Tulsa, OK, USA). При обработке полученных результатов использовали методы параметрической и непараметрической статистики (t-тест Стьюдента, χ2, F-критерий Фишера) согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [17].

Результаты и их обсуждение

Нейромедиатор серотонин выполняет множественные функции по модулированию информационных процессов посредством активации обширного семейства 5-НТ-рецепторов, включающего подтипы семиспиральных рецепторов GPCRs (5-HT1, 5-HT2, 5-HT4-7) и канальный 5-HT3. Наибольшая   популяция   серотонергических нейронов локализована в среднем мозге, особенно в ядрах шва (raphenuclei). Медиальное и дорзальное ядра шва обеспечивают общие проекции, иннервация базальных ядер (стриатума, субталамических ядер, чёрной субстанции) осуществляется из второго, входя в т. н. «кортико-базальноталамические» пути, играющие роль в контроле моторных, эмоциональных и когнитивных функций [16, 18]. Следовательно, 5-HT2А-рецепторы представляют собой важные мишени для воздействия фармакологическими средствами [8]. Открытие [3H]-Кетансерина в качестве селективного лиганда для рецепторов 5-НТ2А-подтипа [19] оказалось важным событием, которое существенно продвинуло исследования этих важных рецепторов.

Для изучения индивидуально-типологического рецепторного профиля препаратов использовали апробированный комплексный поведенческо-нейрохимический подход с привлечением неинвазивной методики типирования животных по уровню эффективности исследовательского поведения в закрытом крестообразном лабиринте [13]. После субхронического введения ноотропных препаратов типированным животным в условиях насыщения радиолигандного связывания exvivo тритированного лиганда серотониновых рецепторов кетансерина изучали изменение характеристик связывания 5-НТ2А-рецепторов в стриатуме.

Модуляция эффективности синаптической передачи рецепторами осуществляется двумя молекулярными механизмами. С одной стороны, это изменение чувствительности (сродства) к рецептору, с другой – увеличение или снижение количества активных рецепторов на мембране. Чтобы определить, с чем связаны изменения в специфическом связывании [3Н](+)Кетансерина с мембранами стриатума – с изменениями в сродстве или количестве мест связывания, – были проведены кинетические исследования по определению параметров связывания – константы диссоциации Кd и максимального числа мест связывания Вmах. Для этого был применён метод насыщения связывания радиолиганда мембранами стриатума, результаты которого для субпопуляций НЭИП и ВЭИП приведены на рис. 1А и Б соответственно. Далее эти зависимости были преобразованы в координатах Скетчарда (рис. 2А и Б), из которых были рассчитаны величины Вmах и Кd, представленные в табл. 1.

Таким образом, было установлено, что у контрольных животных из субпопуляции с НЭИП количество мест связывания [3Н](+)Кетансерина в стриатуме на 20 % ниже (Bmax = 519 ± 13 фмоль/мг), чем у субпопуляции с ВЭИП (Bmax = 639 ± 48).

Эти данные совпадают со сведениями о меньшем содержании 5-НТ2А-рецепторов в мозге больных с мягкими когнитивными нарушениями, которые были получены с помощью методов ядерно-магнитного резонанса (MRI) и позитронно-эмиссионной томографии (PET) c использованием [18F]-алтансерина. При этом сниженная плотность 5-НТ2А-рецепторов в стриатумах больных существенно коррелировала с проявлением депрессии и тревоги по шкале NPI-Q [20].

С другой стороны, оставалась не изученной роль 5-НТ2А-рецепторов в механизме действия ноотропных препаратов. В ранее опубликованных работах нами было показано, что специфический эффект ноотропов проявляется при использовании животных с когнитивным дефицитом, который сопровождался сниженной плотностью NMDA-рецепторов и концентрацией мозгового фактора BDNF в гиппокампе, увеличенным количеством н-холинорецепторов в префронтальной коре мозга мышей [11, 13, 15].

Поэтому в следующей серии экспериментов были изучены эффекты субхронического введения отечественных ноотропов пантокальцина, семакса и нооглютила в сравнении с пирацетамом на связывание [3Н](+)Кетансерина мембранами стриатумов мышей с низкой и высокой эффективностью поведения в закрытом крестообразном лабиринте.

Субхроническое введение каждого из четырёх препаратов увеличило количество мест связывания [3Н](+)Кетансерина только у животных с НЭИП: пирацетам на 24 % (Bmax = 643 ± 42 фмоль/мг); нооглютил на 120 % (Bmax = 1145 ± 136 фмоль/мг); семакс на 43 % (Bmax =742 ± 29 фмоль/мг) и пантокальцин на 28 % (Bmax = 662 ± 29 фмоль/мг). В группах с ВЭИП статистически значимых изменений в количестве рецепторов серотонина под действием препаратов не наблюдалось (см. табл. 1) (рис. 2).

Величина константы диссоциации (Кd) оставалась неизменной между субпопуляциями. После субхронического введения препаратов также не наблюдалось статистически значимых изменений в данном параметре радиолигандного связывания (табл. 1) (рис. 1–2).

Следовательно, наличие серотонин-позитивных эффектов у всех исследованных препаратов на животных с пониженным содержанием рецепторов согласуется с ранее полученными данными [11] об избирательном, модулирующем характере действия веществ с ноотропным эффектом. Обнаруженное увеличение количества 5-HT2А-рецепторов серотонина, возможно, связано со стимуляцией препаратами нейропластических процессов в головном мозге.

Выводы

1. Субпопуляция мышей линии 1CR, характеризующаяся низкой эффективностью исследовательского поведения в крестообразном лабиринте, обладает 20 % дефицитом мест специфического связывания [3H](+)Кетансерина в мембранах стриатума по сравнению с мышами с высокой исследовательской активностью.

2. Показано, что 5-кратное системное введение пирацетама, пантокальцина, семакса и ноотропила увеличивает, соответственно, на 24, 28, 43 и 120 % показатели плотности 5-НТ2А-рецепторов мембранами стриатума лишь в субпопуляции со сниженной эффективностью исследовательского поведения.

3. Результаты указывают на специфический модулирующий характер участия 5-НТ2А-рецепторов стриатума в механизме действия ноотропных препаратов при неинвазивном моделировании дефицита исследовательской активности.