Нейропротекторное действие миоинозитола на клеточной модели глутаматного стресса как основа для профилактики нарушений внутриутробного развития головного мозга

Введение

Нейропротекция мозга плода чрезвычайно важна на всех стадиях беременности. На ранних сроках беременности нейропротекция необходима для профилактики врождённых пороков развития мозга (ВПРМ); в течение всей беременности (особенно в последнем триместре) – для профилактики ишемии головного мозга плода.

Аномалии развития ЦНС плода возникают вследствие нарушений процессов размножения, миграции, дифференциации и программированной гибели клеток во время роста эмбриона. Важным фактором формирования ВПРМ является сахарный диабет, осложняющий течение беременности не менее чем у 2,4 % беременных [1]. Профилактика ВПРМ фолатами не эффективна в случае т. н. «фолат-резистентных» пороков развития, так как фолаты далеко не единственный микронутриент, необходимый для развития ЦНС плода.

Одним из важнейших нейроактивных микронутриентов, который принимает комплексное участие в эмбриогенезе и развитии мозга плода, является миоинозитол (витамин В8), специфическая разновидность шестиатомных спиртов – инозитолов. Инозитолы (циклогексан-1,2,3,4,5,6-гексолы) представлены девятью стереоизомерами, из которых именно миоинозитол (рис. 1) имеет принципиальное значение для функционирования всех типов клеток. Миоинозитол и его фосфатные производные (инозитолфосфаты, фосфатидилинозитоловые липиды) выступали в качестве важных передатчиков сигнала во внутриклеточных сигнальных каскадах.

В реферируемых научных журналах представлено более 40 000 публикаций о молекулярно-физиологических механизмах действия миоинозитола, включающих также и результаты клинических исследований. В работе [2] представлены результаты анализа всего массива публикаций по миоинозитолу, проведённого посредством современных методов интеллектуального анализа данных. Показано, что производные миоинозитола участвуют в передаче сигналов от рецепторов ростовых факторов, рецептора инсулина [3], расщеплении жиров производных миоинозитола и снижении уровня холестерина в крови [4], модуляции активности нейротрансмиттеров [5] и др.

Анализ 120 миоинозитол-зависимых белков протеома человека показал, что более половины этих белков вовлечены в поддержку жизнедеятельности сердечно-сосудистой системы, иммунитета и структуры соединительной ткани (включая эффекты на поддержание состояния костей, хряща, кожи и процессы заживления ран). Не менее важно участие миоинозитола в метаболизме сахаров (прежде всего, сигнальном каскаде инсулина) и в поддержании функционирования ЦНС (включая нейротрофические и нейропротекторные роли, рис. 2) [2].

Аномалии метаболизма миоинозитола ассоциированы с когнитивными нарушениями [6], депрессией [7], диабетической нейропатией [8] и др. Фундаментальные и клинические исследования показали, что миоинозитол необходим для поддержки нейрональной функции, включая синаптическую передачу и осуществление физиологических эффектов таких нейротрансмиттеров, как серотонин, дофамин, ГАМК, нейромедин. Миоинозитол необходим для нейрогенеза (нейротрофический эффект), нейропротекции (в т. ч. защиты клеток сетчатки глаза), осуществления процессов зрения, слуха, вкуса и долговременной потенциации в гиппокампе (поддержка памяти).

Столь широкий спектр биологических активностей миоинозитола позволяет предположить, что миоинозитол может проявлять и более специфические воздействия на сигнальные каскады выживания нейронов в условиях стресса (гипоксия, нейротоксичность глутамата, энергетический дефицит и гипогликемия, дисфункция митохондрий, избыточное воспаление и др.). В настоящей работе проведена валидация нейропротекторных эффектов миоинозитола методами нейроцитологии, изучающими действие веществ непосредственно на нейроны [9–11].

Нейроцитологические исследования позволяют установить прямые нейропротекторные эффекты препаратов при разных стрессорных воздействиях. Например, при ишемии головного мозга таковыми являются энергетический дефицит, нейротоксичность глутамата, оксидативный стресс, дисфункция митохондрий, метаболический ацидоз [12]. Нейроцитологические исследования позволяют демонстрировать влияние препаратов на конкретные факторы стресса и доказывать непосредственное действие исследуемого препарата именно на выживание нейронов (а не на другие типы клеток) [13, 14].

В настоящей работе представлены результаты экспериментальной валидации прямого нейропротекторного действия миоинозитола (в синергидной комбинации с фолиевой кислотой, препарат Ферти на, 1 пакетик-саше содержит порошок растворимый Инозит 1000 мг и Фолиевую кислоту 100 мкг, пр-во Орион Фарма, рег. №: RU.77.99.88.003.E.002116.05.18от 25.05.18). Исследования проводились на зернистых нейронах мозжечка новорождённых крыс, выращиваемых в культуре в условиях глутаматного стресса. Эти исследования предоставили уникальную возможность продемонстрировать прямое нейропротекторное действие миоинозитола на нейроны мозга плода. Во-первых, воспроизведение глутаматного стресса физиологически адекватно моделирует условия умеренной ишемии мозга, возникающей при внутриутробном развитии плода. Во-вторых, изучение воздействия миоинозитола непосредственно на нейроны, без прохождения через центральное кровообращение, печень и другие системы организма, позволяет доказать, что именно миоинозитол (а не какие-то другие изменения в организме, вызываемые приёмом препарата) проявляет нейропротекторное действие.

Материалы и методы

В работе использовались 7-8-суточные культуры, полученные методом ферментно-механической диссоциации клеток мозжечка 7-дневных крыс по общепринятой методике. Крысы подвергались летальной дозе эфирного наркоза, после чего 5 минут стерилизовались 70 % спиртом. Далее производилось извлечение мозжечка и перенесение его в пластиковую чашку Петри, заполненную фосфатным буфером, лишенным ионов кальция и магния. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37 °С в фосфатном буфере, содержащем 0,05 % трипсина, 0,02 % ЭДТА и 0,8 % глюкозы. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и один раз средой культивирования, далее подвергали механической диссоциации в питательной среде для культивирования. В состав питательной среды входит 90 % минимальной среды «Игла», 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 5 мМ KCl и 10 мМ буфера НЕРЕS, pH7,2–7,4. Суспензию клеток центрифугировали 1 мин при 1000 об./мин, супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в питательной среде.

Культивирование нейронов производили в 96-луночных пластиковых планшетах, покрытых полиэтиленимином или полилизином (25 мМ хлорида калия). В каждую ячейку планшета добавляли по 0,1 мл суспензии клеток. Культивирование производили 7–8 суток в СО2-инкубаторе, заполненном газовой смесью (95 % воздуха +5 % СО2), при температуре 35,5 °С и относительной влажности 98 %. К этому сроку культивированные зернистые нейроны (КЗН) достигали своей морфологической и нейрохимической зрелости. Состояние культур контролировали ежедневно и на каждом этапе эксперимента путём визуального просмотра в инвертированном микроскопе при фазовом контрасте. Вещества добавляли в среду культивирования на 2 сутки in vitro на весь срок культивирования (до 7 суток). Исходя из концентрации вещества в пробирке (10 мМ), его минимально возможное разведение для добавления к культурам 1:10, чтобы сохранить необходимые свойства питательной среды, т. е. 1 мМ. 96-луночные пластиковые планшеты дали возможность тестировать сразу 4 различные концентрации образцов. Были выбраны следующие концентрации: 0,1; 0,2; 0,5; 1 мМ.

Количественную оценку выживаемости клеток производили с помощью прямого подсчёта живых нейронов. Клетки-зерна легко идентифицировать прижизненно как небольшие, 7-10 мкм в диаметре, округлые или овальные нейроны. При окраске фиксированных культур трипановым синим хорошо видны ядра КЗН, занимающие большую часть тел нейронов и окруженные тонким ободком цитоплазмы (рис. 3).

Для каждого вещества было выполнено как минимум 3 эксперимента, при этом на каждую точку брали по 3 культуры, в каждой из которых фотографировали и просчитывали по 5 последовательных полей зрения (как минимум 45 полей зрения из 9 культур 3 независимых экспериментов). Количество нейронов с неизмененной морфологией в контрольных культурах принимали за 100 % выживаемости. Для статистического анализа использовали тест ANOVA с поправками Бонферони и Даннета. Отличия между группами считали достоверными при p < 0,05. Результаты выражали как среднее ± SEM.

Результаты и обсуждение

Предварительное моделирование повреждения культур нейронов глутаматом показало, что глутамат оказывал дозозависимый токсический эффект на выживание нейронов (рис. 4). Выбор концентрации глутамата в каждом опыте осуществлялся таким образом, чтобы выживаемость КЗН составляла 30–80 % от интактного контроля (что соответствует умеренному глутаматному стрессу). При выживаемости нейронов менее 30 % (сильный глутаматный стресс) или более 80 % (слабый глутаматный стресс) нейропротекторные эффекты веществ гораздо менее наглядны.

Известно, что нейропротекторные свойства различных препаратов выявляются, как правило, при достаточно длительном применении. Поэтому при исследовании нейропротекторных свойств миоинозитола и других нейропротекторных средств мы пользовались отработанной нами ранее «профилактической» схемой эксперимента: вещество вносится в среду культивирования на 2-е сутки и оставляется до 7-х суток эксперимента. Затем проводится обработка клеток глутаматом и осуществляется подсчёт числа выживших нейронов [9].

Нейроцитологические эксперименты были проведены для миоинозитола (действующее вещество препарата Фертина, производства ОрионФарма) и таких нейропротекторных средств, как экстракт пептидов мозга свиньи (церебролизин), цитидин-5-дифосфохолин (цитиколин), цитидин-5-дифосфохолинат лития. В ходе исследования было использовано 1 920 культур и произведены подсчёты более чем для 200 тыс. нейронов.

Миоинозитол не проявлял токсических эффектов и не влиял на выживаемость КЗН в контроле, т. е. вхолостом» эксперименте (без добавления глутамата, рис. 5). При воздействии глутамата миоинозитол в концентрации 0,2–0,5 мМ достоверно повышал выживаемость нейронов на 12…17 % (0,2 мМ миоинозитола – 54,9 ± 2,6 %; 0,5 мМ миоинозитола – 59,1 ± 2,9 %, контроль – 42,6 ± 2,2 %, рис. 5). Примеры изображений обсчитанных культур нейронов приведены на рис. 6.

Нейроцитологические исследования других средств показали гораздо менее выраженные нейропротекторные свойства. Например, в случае пептидного экстракта поросят до 6 мес. (церебролизин) был выявлен слабый, но достоверный нейропротекторный эффект – увеличение выживаемости на 5…8 % (общая выживаемость при концентрации пептидного экстракта, равной 0,1 мМ – 53 ± 3 %, при концентрации 0,2 мМ – 52 ± 3 %, контроль – 45 ± 2 %, р < 0,05). Более того, при концентрации пептидного экстракта, равной 1,0 мМ был выявлен слабый токсический эффект – выживало всего 36,3 ± 2,6 % нейронов (рис. 7). Примеры фотографий культур из просчитанных полей зрения приведены на рис. 8.

В случае других исследованных нейропротекторных средств непосредственный нейропротекторный эффект на выживание нейронов практически отсуствовал. Например, при воздействии цитидин-5-дифосфохолина выживаемость в контроле при действии глутамата составила 59,3 ± 3,0 %, а при добавлении цитидин-5-дифосфохолина – не превышала 65 % (0,1 мМ – 63,6 ± 3,6 %, нет достоверных различий, p > 0,05). При этом более высокая концентрация цитидин-5-дифосфохолина, 1 мМ, несколько уменьшала выживаемость КЗН (43,6 ± 2,4 %, рис. 9, 10). Схожая ситуация наблюдалась и при использовании потенциального нейропротектора – цитидин-5-дифосфохолината лития (рис. 11, 12).

Обсуждение результатов

Результаты проведённого нейроцитологического исследования весьма важны как с точки зрения оценки нейропротекторных эффектов миоинозитола, так и с точки зрения эффектов «признанных» нейропротекторов. Как было отмечено выше, нейроцитологические исследования уникальны в том смысле, что позволяют подтвердить прямое нейропротекторное действие изучаемых веществ непосредственно на растущие нейроны плода. В то же время действие других нейропротекторов может быть опосредованным: фосфохолин, например, может оказывать нейропротекторное действие через поддержку функции печени [15].

В результате проведения настоящей серии экспериментов было показано, что «профилактическое» применение действующего вещества препарата Фертина – миоинозитола (за 5 сут. до создания глутаматного стресса) достоверно и существенно (в среднем, на 12…17 %, p = 0,01) повышает выживаемость нейронов в культуре. Создание глутаматного стресса в культуре нейронов моделирует ишемию мозга плода, особенно при патологических родах. Обогащение клеточной среды миоинозитолом до создания глутаматного стресса соответствует профилактическим дотациям миоинозитола во время беременности. Поэтому полученные результаты нейроцитологического исследования имеют существенное значение для антиишемической защиты мозга плода и в ранние, и в поздние сроки беременности.

Ишемический стресс, переносимый эмбрионом в ранние сроки беременности, стимулирует формирование врождённых пороков развития мозга. ВПРМ возникают под действием разнообразных факторов тератогенеза, к которым относятся алкоголь, инфекционные заболевания, передающиеся от матери плоду, ионизирующее излучение, фармацевтические препараты, никотин сигаретного дыма и др. Формирование ВПРМ также является следствием дисбаланса (как правило, недостатка) ростовых факторов, необходимых для роста эмбриона: витамина А, фолатов (витамин В9) и синергидных с ними пиридоксина (витамин В6), цинка, миоинозитола (витамин В8) и других эссенциальных микронутриентов [16].

Большинство ВПРМ (в т. ч. дефекты нервной трубки, ДНТ, расщелины нёба) являются фолат-чувствительными (более 70 %) и их возникновение может профилактироваться дотациями фолатов (предпочтительно в составе витаминно-минеральных комплексов) в ранние сроки беременности. В то же время формирование ВПРМ у пациенток вопреки дотациям фолатов указывает на существование т. н. «фолат-резистентных» ВПРМ (30 %). Риск фолат-резистентных ВПРМ может быть существенно снижен при приёме препаратов миоинозитола [17], поддерживающего эмбриогенез и развитие плода [18].

Установленный нами непосредственный нейропротекторный эффект миоинозитола является важной составляющей эмбриопротекторного действия миоинозитола. В частности, трудно переоценить роль миоинозитола в профилактике ВПР, связанных с инсулинорезистентностью: ведь производные миоинозитола участвуют в процессах передачи сигнала от инсулинового рецептора [19]. Истощение миоинозитола в эмбриональной ткани на этапе органогенеза играет, по всей видимости, важную роль в индуцированнии эмбриопатий, вызываемых гипергликемией. В эксперименте с моделями стрептозоцинового диабета содержание миоинозитола в эмбрионах было снижено на 36 % (p = 0,01) по сравнению с контролем и было ассоциировано с задержкой развития (длина эмбриона 3,37 ± 0,04 мм, контроль – 3,87 ± 0,03 мм, p = 0,01; число сомитов – 27,5 ± 0,2, контроль – 29,1 ± 0,2, p = 0,01) и значительно повышенной частотой нейронных повреждений (17,6 %, контроль – 1,9 %, р < 0,001) [20].

Миоинозитол способствует снижению инсулинрезистентности и одновременно весьма важен для преодоления негативного воздействия повышенных уровней глюкозы на нейроны. В эксперименте приём миоинозитола приводил к значительному снижению частоты развития ДНТ в модели стрептозотоцинового диабета (9,5 %, контроль – 20,4 %, р < 0,05) [21].

Анализ фолат-чувствительных и фолат-резистентных моделей ДНТ [22] в экспериментах по делеции генов позволил установить более 60 генов, инактивация которых приводит к линиям мышей с ДНТ [23]. Не менее 22 из этих 60 генов кодируют белки и ферменты, активность или уровни которых существенно зависят от наличия определённых микронутриентных кофакторов (табл. 1).

Воздействие миоинозитола (витамин В8) на процессы роста эмбриона неразрывно связано с активностью сигнального белка протеинкиназы С, которая поддеживает передачу сигнала от белковых ростовых факторов, гормонов и нейротрансмиттеров (простагландинов, адреналина, ацетилхолина, серотонина, ангиотензина и др.), регулирует вазодилатацию и гликолиз и принципиально важна для процессов роста эмбриона. В эксперименте, проведённом во время нейруляции, было установлено, что противодействие миоинозитола формированию ДНТ связанно с активностью PKC-β1 и PKC-γ [24].

Из перечисленных в табл. 1 генов/белков рассмотрим несколько примеров. В частности, фермент инозитол 1,3,4-трифосфат 5/6-киназа (ген Itpk1) является ключевым регуляторным ферментом синтеза сигнальной молекулы инозитол гексакисфосфата (IP6) – внутриклеточной сигнальной молекулы, участвующей в регуляции ионных каналов, транспорте нутриентов и строительных материалов через клеточную мембрану (эндоцитоз, экзоцитоз), транскрипции и репарации ДНК [25]. Животные с делецией/инактивацией гена жизнеспособны, фертильны, но их эмбрионы часто обнаруживали ДНТ, осевые дефекты скелета, замедление роста и повышенную гибель нейронов (рис. 13). Таким образом, миоинозитол-зависимый фермент Itpk1 необходим для адекватного развития нервной трубки и профилактики ДНТ (рис. 14) [26].

Фермент фосфатидилинозитол-4-фосфат 5-киназа (PIP5K, ген PIP5K1С) катализирует синтез одной из основных внутриклеточных сигнальных молекул – фосфатидил инозитол дифосфата (PIP2). Изоформа фермента PIP5K-γ необходима для развития сердечно-сосудистой и центральной нервной систем. Целенаправленная инактивация γ-изофермента PIP5K в эксперименте вызывала многочисленные нарушения роста клеток и развития тканей, в т. ч. приводящие к сердечной недостаточности (рис. 15), усилению гибели нейронов и дефектам нервной трубки (рис. 16) [27].

Заключение

Ишемические повреждения ЦНС плода – основная причина многочисленных заболеваний нервной системы у новорождённых. На ранних сроках беременности хроническая ишемия ЦНС приводит к порокам развития мозга. Хроническая ишемия мозга плода на более поздних сроках ассоциирована с высоким риском асфиксии в родах, дискоординацией родовой деятельности; повышается риск пост-гипоксической энцефалопатии, т. н. «минимальной мозговой дисфункции» и детского церебрального паралича. Хроническая ишемия мозга плода усугубляется на фоне инсулинрезистентности и глюкозотолератности.

Миоинозитол необходим для синтеза инозитолфосфатов и фосфатидилинозитоловых липидов, которые опосредуют передачу сигнала от рецепторов ростовых факторов и нейротрансмиттеров внутрь клетки. Эти производные миоинозитола крайне важны для развивающегося мозга, т. к. обеспечивают адекватную коммуникацию между нейронами, снижают хроническую ишемию нейронов и противодействуют глюкозотолератности.

Представленные в работе результаты указывают на выраженный нейропротекторный эффект миоинозитола на рост нейронов в культуре в условиях глутаматного стресса (повышение выживаемости нейронов, в среднем на +17%). Прямое нейропротекторное действие миоинозитола указывает на важность использования миоинозитола как для профилактики пороков развития, возникающих на ранних сроках беременности, так и для нейропротекции мозга плода на поздних сроках беременности. Подчеркнём, что в дотациях миоинозитола особенно нуждаются беременные с диетой, перегруженной углеводами, женщины с диабетом (в т. ч. гестационным), женщины, ранее родившие ребёнка с тем или иным пороком развития.