Экспериментальное обоснование in vivo методики оценки субстратов и модуляторов активности белка-транспортёра BCRP

Введение

BCRP (breast cancer resistance protein — белок резистентности рака молочной железы) (ABCG2, MXR; ABCP) — эффлюксный АТФ-зависимый белок-транспортёр, в норме локализующийся в различных гистогематических барьерах, таких как гематоэнцефалический, плацентарный и гематотестикулярный барьеры [1]. Транскрипты белка были обнаружены в тонком и толстом кишечнике, печени, почках, желчных протоках и ряде других органов. Подобное расположение подтверждает его участие в процессах всасывания, распределения и выведения лекарственных веществ, которые относятся к его субстратам [2, 3].

Данный белок обладает широкой субстратной специфичностью и способен переносить многочисленный ряд лекарственных препаратов: митоксантрон, метотрексат, сульфасалазин, розувастатин и т. д. [2–4]. Некоторые из этих соединений могут существенно влиять на его функциональную активность, так в настоящее время изучены следующие ингибиторы белка-транспортёра (кверцетин, резерпин, нимодипин, омепразол и др.) [2, 3]. Активно разрабатываются индукторы BCRP [2, 3, 5].

При совместном назначении субстрата и ингибитора BCRP концентрация субстрата в крови повышается, что, в свою очередь, сопровождается развитием нежелательных лекарственных реакций [6]. Например, одновременное назначение сульфасалазина и антагониста нейрокинина I ролапитанта может привести к увеличению всасывания сульфасалазина из тонкого кишечника, а вследствие этого, к уменьшению количества препарата в просвете кишечника и снижению терапевтической эффективности при лечении болезни Крона. К тому же повышение концентрации субстрата в плазме крови в этом случае может вызвать увеличение частоты проявления системных побочных эффектов [7].

Учитывая вышеизложенное, для повышения эффективности и безопасности проводимой терапии, прогнозирования развития фармакокинетических межлекарственных взаимодействий ведущие мировые регуляторные органы рекомендуют тестировать лекарственные вещества на принадлежность к субстратам и ингибиторам BCRP, а также других клинически значимых транспортёров (Pgp, OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT3, OCT2) [8, 9].

Согласно международным рекомендациям, первоначально подобные исследования проводят in vitro на линии клеток гиперэкспрессирующих BCRP. А затем при положительном результате рекомендуется проводить клинические исследования без проведения тестирования на лабораторных животных. Однако данный подход не учитывает непрямое действие лекарственных веществ на транспортёры, в частности, влияние на уровень экспрессии гена, кодирующего транспортёр, что показывает увеличение или уменьшение его синтеза, с чем может быть связано изменение его количества и функциональной активности. Например, явление индукции транспортёров невозможно установить в опытах in vitro, подобных рекомендаций в существующих руководствах нет. Такое влияние можно оценить только в опытах in vivo на экспериментальных животных при курсовом введении тестируемого препарата [10].

Поэтому необходимо разработать адекватную воспроизводимую экспериментальную методику, позволяющую оценивать принадлежность лекарственных веществ к субстратам и модуляторам активности BCRP в опытах in vivo.

Учитывая схожесть аминокислотного состава BCRP у человека и кроликов, возможность многократного забора крови у одного животного и планирование дизайна эксперимента по аналогии с клиническим исследованием, биоэтические проблемы при использовании большого количества крыс и мышей, предшествующий опыт исследований in vivo, именно кролики были выбраны в качестве удобной и адекватной тест-системы в настоящем исследовании [11, 12].

Цель — разработать и экспериментально обосновать методику тестирования лекарственных веществ на принадлежность к субстратам и модуляторам активности BCRP в опытах in vivo.

Материалы и методы

В исследовании использовали 6 половозрелых самцов кроликов породы Советская Шиншилла, массой 3000–4000 г.

Кроликов содержали в условиях стандартной экспериментальной биологически чистой комнаты вивария ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, с системой «чистого» и «грязного» коридоров и автоматической сменой дневного и ночного периода. В помещении с животными поддерживалась температура 21–24 °C и влажность 55–65 %, при как минимум 12-кратной смене воздушного объёма в час.

Исследования выполняли в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики (Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 N 81 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств») [13].

Выполняемые эксперименты были одобрены комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (протокол № 11 от 29.01.2018 г.).

По окончании эксперимента животным производилась эвтаназия путём передозировки средств для наркоза в соответствии с СОП вивария ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (внутримышечным введением золетила в дозе 30 мг/кг массы и ксилазина в дозе 20 мг/кг массы с помощью стерильного одноразового шприца объёмом 2 мл).

Дизайн исследования. Исследование выполнено в последовательном эксперименте на 6 кроликах самцах. Для оценки принадлежности веществ к субстратам и ингибиторам BCRP в качестве субстрата использовали сульфасалазин, а ингибитора — кверцетин.

Сульфасалазин и кверцетин были выбраны как классические вещества с доказанной субстратной принадлежностью (первое) и ингибирующей активностью (второе), а также мало выраженными системными побочными эффектами при пероральном введении, связанными с плохим всасыванием из кишечника, что могло бы повлиять на результаты эксперимента.

Для оценки принадлежности тестируемого вещества к субстратам BCRP следует сравнить его ключевые фармакокинетические параметры, связанные с концентрацией в крови (Cmax, AUC0-t, AUC0-∞), на фоне введения ингибитора с исходными. Если 90 % ДИ отношения средних геометрических указанных параметров достоверно увеличился более чем на 25 %, то тестируемое вещество является субстратом изучаемого транспортёра.

Для оценки принадлежности тестируемого вещества к ингибиторам транспортёра в эксперименте in vivo выбирают известный субстрат BCRP. В настоящем исследовании мы использовали сульфасалазин, а тестируемое вещество вводят однократно и/или курсом перед вторым введением сульфасалазина. Если 90 % ДИ отношения средних геометрических величин фармакокинетических параметров сульфасалазина (Cmax, AUC0-t, AUC0-∞) достоверно выходит за пределы 0,80–1,25 в сторону увеличения по сравнению с исходными, то тестируемое вещество — ингибитор изучаемого транспортёра, если 90 % ДИ ниже данного диапазона — то индуктор.

В ходе эксперимента в 1-й серии исследования животным внутрижелудочно (в/ж) вводили классический субстрат BCRP — сульфасалазин («Сульфасалазин», 500 мг, ООО «Озон», Россия) в дозе 125 мг/кг [14]. Затем из краевой вены уха кроликов забирали образцы крови в количестве 1 мл в гепаринизированные центрифужные пробирки объёмом 15 мл в следующие временные точки — 0,25 ч; 0,5 ч; 1 ч; 1,5 ч; 2 ч; 3 ч; 5 ч; 8 ч; 12 ч; 24 ч. После чего образцы центрифугировали (центрифуга «Elmi CM 6M», Латвия (1750 g, 10 мин) для получения плазмы крови, которую замораживали при −80 °С до выполнения количественного анализа (серия 1 — в/ж введение сульфасалазина).

После отмывочного периода продолжительностью 7 дней, необходимого для полного выведения сульфасалазина и восстановления животных после забора крови [15] следовала 2-я серия эксперимента, состоящая из двух этапов. Изначально животным однократно вводили классический ингибитор BCRP — кверцетин («Кверцетин», 25 мг, «Эвалар», Россия) в дозировке 100 мг/кг и через 30 мин повторно вводили сульфасалазин в той же дозе и забирали кровь у животных в тех же временных точках (рис. 1).

Далее также следовал отмывочный период, после которого начинали курсовое введение кверцетина в дозировке 25 мг/кг в течение 7 дней. На 7-й день животным вводили кверцетин — 25 мг/кг и через 30 мин сульфасалазин в дозе 125 мг/кг и забирали кровь у животных в тех же 10 временных точках.

Количественный анализ сульфасалазина в полученных образцах плазмы крови осуществляли методом ВЭЖХ-МС/МС при помощи ВЭЖХ «Ultimate 3000» («ThermoFisher», США), оснащённого автосемплером, и масс-спектрометра TSQ Fortis («ThermoFisher», США) по ранее разработанной и валидированной методике [16].

Пробоподготовка заключалась в осаждении белков плазмы после разморозки проб путём добавления к 200 мкл образца 600 мкл смеси метанола с валсартаном (внутренний стандарт) в концентрации 100 нг/мл. Затем пробы встряхивали 5 мин на встряхивателе (Vortex (Heidolph Instruments GmbH & Co KG, Германия)), центрифугировали 10 мин при 21000 g и 4 °С (центрифуга Avanti® JXN-30 (Beckman Coulter Inc., США). Супернатант переносили в виалы и помещали в автосамплер, объём инжекции — 100 мкл.

Условия хроматографического анализа были следующие: колонка Luna Omega 3 мкм Polar C18 50×2.1, 3 um, предколонка аналогичного типа — C18 3 мкм. Температура разделения — 35 °С, скорость потока — 0,3 мл/мин. Применяли градиентный режим элюирования (соотношение 0,1 % раствор муравьиной кислоты/метанол): 0,0 мин — 60/40 %, 0,3 мин — 15/85 %, 4 мин — 1/99 %, 6 мин — 60/40 %, 8 мин — 60/40 %. Использовали режим негативной ионизации. Метод детектирования — тандемная масс-спектрометрия. Температура ион-транспортирующего капилляра — 300 °С, температура испарителя — 350 °С. Фрагментирующий газ — аргон с потоком 2 mTorr (мТорр), фрагментация в источнике составила 10В. Объём инжекции — 10 мкл, время анализа — 8 минут.

Методика была валидирована по параметрам: селективность, нижний предел количественного определения, линейность, правильность, прецизионность, эффект переноса, стабильность, матричный эффект и эффект извлечения.

Фармакокинетический анализ. По полученным концентрациям субстрата строили фармакокинетические кривые. Далее модельно-независимым методом рассчитывали следующие фармакокинетические параметры сульфасалазина:

• Cmax — максимальная концентрация (нг/мл);

• AUC0–t — площадь под фармакокинетической кривой концентрация—время от нуля до времени последнего забора крови (нг×ч/мл) (рассчитывали методом трапеций);

• AUC0–∞ — площадь под фармакокинетической кривой концентрация—время от нуля до бесконечности (нг×ч/мл);

• T1/2 — период полувыведения (ч).

Статистический анализ. Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью программ офисного пакета «Microsoft Office XP» и программы GraphPad Prism 10.0 (GraphPad Software, Inc., США). Для определения статистически значимых различий в группах использовали дисперсионный анализ (ANOVA), сравнение групп с контролем выполняли методом Тьюки. Полученные результаты представлены в виде среднего геометрического и его 90 % доверительного интервала. Дополнительно рассчитывали двусторонний 90 % доверительный интервал (ДИ) отношения средних геометрических фармакокинетических параметров сульфасалазина. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

Результаты

Рис. 1. Схема выполнения экспериментов для 1- и 2-й серий исследований
Источник: Поветко М. И. и соавт., 2025.

Рис. 2. Усреднённые фармакокинетические кривые «концентрация—время» сульфасалазина (125 мг/кг) в серии контроля, после однократного (100 мг/кг) и курсового (25 мг/кг) введения кверцетина
Источник: Поветко М. И. и соавт., 2025.

Из представленных данных видно, что в серии контроля (исходные данные) у кроликов сульфасалазин медленно всасывается и достигает Cmax к 5 часам, при этом он также медленно выводится и сохраняется в системном кровотоке до 24 часов.

Однократное введение кверцетина достоверно повышало значение Cmax сульфасалазина в 1,62 раза (90 % ДИ отношения средних геометрических 1,12–2,35; p = 0,0418), остальные изучаемые фармакокинетические параметры AUC0–t, AUC0–∞ и T1/2 достоверно не изменялись (p > 0,05). Полученные данные показывают увеличение концентрации сульфасалазина в крови и свидетельствуют о повышении скорости всасывания сульфасалазина после однократного введения кверцетина, что характеризует ингибирование эффлюксного транспортёра BCRP (табл. 1).

После курсового внутрижелудочного введения кверцетина в течение 7 дней Cmax сульфасалазина увеличивалась в 3,1 раза (90 % ДИ отношения средних геометрических 1,97–4,90; p = 0,0032), AUC0-t в 2,81 раза (90 % ДИ 1,78–4,45; p = 0,0048) и AUC0-∞ в 2,49 раза (90 % ДИ 1,42–4,38; p = 0,0192) (табл. 2). Полученные результаты свидетельствуют о значительном увеличении концентрации сульфасалазина в крови, ускорении скорости и степени его всасывания после курсового введения кверцетина, что характеризует ингибирование BCRP.

Более выраженные изменения концентрации субстрата белка-транспортёра после курсового введения кверцетина доказывают, что для выявления ингибирующего эффекта тестируемого препарата предпочтительно использование его курсового, а не однократного введения (рекомендуемый курс 7 дней) для более значимого изменения активности BCRP.

T1/2, характеризующий выведение сульфасалазина, ни после однократного, ни после многократного введения кверцетина не изменялся.

Сопоставление однократного и курсового введения ингибитора BCRP кверцетина наглядно демонстрирует зависимость изменения фармакокинетических параметров, определяющих концентрацию вещества-субстрата в крови, не только от дозы, но и от длительности введения исследуемого вещества в качестве предполагаемого ингибитора (табл. 3). Cmax при курсовом введении в сравнении с однократным достоверно увеличивалась в 1,91 раза (90 % ДИ 1,18–3,13; p = 0,0386), AUC0–t — в 2,12 раза (90 % ДИ 1,44–3,39; p = 0,0106), AUC0–∞ — в 2,17 раза (90 % ДИ 1,28–3,99; p = 0,0127). T1/2 также статистически значимо не изменялся.

Таблица 1. Усреднённые фармакокинетические параметры сульфасалазина (125 мг/кг) у кроликов до и после однократного введения кверцетина в дозе 100 мг/кг массы (среднее геометрическое и его 90 % ДИ)

Примечание: * – p < 0,05 – достоверные различия с показателями контроля.

Таблица 2. Усреднённые фармакокинетические параметры сульфасалазина (125 мг/кг) у кроликов до и после курсового введения кверцетина в дозе 25 мг/кг массы в течение 7 дней (среднее геометрическое и его 90 % ДИ)

Примечания: * – p < 0,05, ** – p < 0,01 – достоверные различия с показателями контроля.

Таблица 3. Сравнение усреднённых фармакокинетических параметров сульфасалазина (125 мг/кг) у кроликов после однократного (100 мг/кг массы) и курсового (25 мг/кг массы) введения кверцетина в течение 7 дней (среднее геометрическое и его 90 % ДИ)

Примечание: * — p < 0,05 — достоверные различия между сериями однократного и курсового введения кверцетина.

Обсуждение

Сульфасалазин, выбранный в качестве субстрата для разработки и экспериментального обоснования методики оценки принадлежности тестируемых веществ к субстратам и модуляторам активности BCRP, обладает высоким аффинитетом к данному белку-транспортёру [17]. Сульфасалазин считается селективным субстратом BCRP, т. к. в его трансмембранном переносе не участвуют другие ABC-транспортёры — P-гликопротеин и MRP2 [18–20]. При этом, в отличие от ряда иных высокоселективных субстратов (митоксантрон, метотрексат), для него не характерны цитотоксические свойства и высокая частота проявления системных побочных эффектов, которые способны оказать влияние на активность транспортёра [21]. Перечисленные характеристики делают его оптимальным кандидатом-субстратом для экспериментального обоснования указанной выше методики в опытах in vivo.

Кверцетин — селективный ингибитор, обладающий низкой себестоимостью и малым количеством побочных эффектов, в отличие от иных ингибиторов, рекомендуемых для исследований (лапатиниб, гефитиниб, рабепразол) [22]. В сравнении с куркумином, другим пищевым биологически активным продуктом, данное вещество имеет большую ингибирующую активность: IC50 куркумина = 1,6 мкМ; IC50 кверцетина = 0,6 мкМ [21, 22].

Таким образом, выбранные для разработки и экспериментального обоснования методики вещества являются оптимальными, селективными и безопасными при однократном и курсовом использовании у лабораторных животных. При анализе данных литературы подобное сочетание субстрата и ингибитора в экспериментах показало возможность его использования у крыс и собак породы бигль [22, 23], однако авторы применяли другие дозы, однократное введение кверцетина и целью их работы было подтвердить ингибирующее влияние кверцетина в экспериментах in vivo.

Полученные нами результаты выявили наличие у кверцетина ингибирующей способности в отношении белка-транспортёра BCRP в экспериментах in vivo у кроликов и согласуются с полученным ранее результатом на других видах животных. Подобная ингибирующая активность в целом отмечается для ряда флавоноидов (гесперидин; акацетин; кампферол и т. д.), что можно связать со схожими свойствами и структурой у данной группы соединений [24].

Значимое снижение активности белка-транспортёра наблюдалось как при однократном (100 мг/кг), так и при курсовом введении кверцетина в дозировке 25 мг/кг, но было достоверно более выражено для большего количества фармакокинетических параметров при курсовом применении в течение 7 дней по сравнению с серией однократного применения ингибитора.

При этом обращает на себя внимание достоверное изменение параметров Cmax и AUC, которые характеризуют его концентрацию в крови, скорость и степень всасывания вещества, в то время как T1/2, показывающий выведение препарата, не изменился, что согласуется с данными других исследований [22].

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ингибирование BCRP развивается, в основном, на уровне ЖКТ. Вероятнее всего это связано с низкой биодоступностью кверцетина [25] и как следствие с тем, что в системном кровотоке его концентрация недостаточна для ингибирования белка-транспортёра в других органах и тканях.

Заключение

В ходе исследования была разработана и экспериментально обоснована оригинальная методика тестирования лекарственных веществ на принадлежность к субстратам и модуляторам активности белка-транспортёра BCRP с использованием в качестве тест-системы кроликов-самцов породы «Советская Шиншилла», в качестве субстрата транспортёра — сульфасалазина (125 мг/кг), а его ингибитора — кверцетина при однократном (100 мг/кг) и курсовом (25 мг/кг 7 дней) введении. Данную методику можно использовать для изучения функциональной активности белка-транспортёра на фоне лекарственных веществ с целью прогнозирования фармакокинетических межлекарственных взаимодействий на уровне BCRP.