Методика количественного анализа маркерного субстрата ABCB1-белка фексофенадина в лизате клеток Caco-2

Один из способов анализа активности ABCB1-белка — это оценка накопления его субстрата фексофенадина (Ф.) внутри тест-клеток. Цель — разработка и валидация методики количественного анализа Ф. в лизате клеток Caco-2 с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Материалы и методы. В качестве матрицы использовался лизат клеток Caco-2. Анализ выполняли на хроматографе «Ultimate 3000» с тройным квадрупольным масс-детектором TSQ Fortis, колонкой UCT Selectra C18 4,6 мм×100 мм 5 мкм в градиентном режиме элюирования. Скорость подвижной фазы — 0,3 мл/мин, объём пробы — 20 мкл, режим ионизации — положительный, внутренний стандарт — амантадин (нг/мл). Пробоподготовка — осаждение белка лизата клеток ацетонитрилом. Методику валидировали по параметрам: селективность, линейность, нижний предел количественного определения (НПКО), правильность, прецизионность, перенос пробы и стабильность образцов. Результаты. На хроматограммах холостого лизата клеток Caco-2 не было пиков со временем удерживания, характерным для Ф. (5,70 мин) и амантадина (3,58 мин). НПКО Ф. составил 0,5 нг/мл. Перенос Ф. не превышал 20 % НПКО, а амантадина — 5 %. По результатам анализа трёх серий градуировочных стандартов (0,5; 1; 1,5; 5; 10; 25; 40; 50 нг/мл) получены уравнения линейной регрессии, коэффициенты корреляции превышали 0,99. Правильность и прецизионность оценивали внутри и между циклами, выполняя анализ растворов Ф. в матрице (0,5; 1,5; 25 и 40 нг/мл) в рамках трёх циклов. Параметры не превышали 20 % для НПКО и 15 % — для остальных точек. Стабильность растворов Ф. (1,5 и 40 нг/мл) в лизате анализировали при хранении при комнатной температуре, после 3-кратной заморозки–разморозки, хранении при -80 °С 60 сут., после пробоподготовки и нахождения в автосемплере 24 ч. Правильность находилась в пределах 15 % от номинальных значений. Выводы. Разработана и валидирована методика количественного определения Ф. в лизате клеток Caco-2 с помощью ВЭЖХ-МС/МС.

1. Spudich A, Kilic E, Xing H, et al. Inhibition of multidrug resistance transporter-1 facilitates neuroprotective therapies after focal cerebral ischemia. Nat Neurosci. 2006 Apr;9(4):487–8. DOI: 10.1038/nn1676.

2. Черных И.В., Щулькин А.В., Якушева Е.Н., Попова Н.М. Роль гликопротеина-Р в неврологии. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2017;117(1):67–71. [Chernykh IV, Shchulkin AV, Yakusheva EN, Popova NM. A role of P-glycoprotein in neurology. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(1):67–71. (In Russ).]. DOI: 10.17116/jnevro20171171167-71.

3. Сычев Д.А., Кукес В.Г., Каркищенко Н.Н. Методические рекомендации по изучению биотрансформации и транспортеров новых лекарственных средств: дизайн исследований, анализ данных: руководство по экспертизе лекарственных средств. М.: Гриф и К; 2014. [Sychev DA, Kukes VG, Karkishhenko NN. Metodicheskie rekomendacii po izucheniyu biotransformacii i transporterov novy`x lekarstvenny`x sredstv: dizajn issledovanij, analiz danny`x: rukovodstvo po e`kspertize lekarstvenny`x sredstv. Moscow: Grif i K; 2014. (In Russ).].

4. Clinical Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions Guidance for Industry. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Clinical Pharmacology. (2020).

5. In Vitro Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions Guidance for Industry. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Clinical Pharmacology. (2020).

6. Sambuy Y, De Angelis I, Ranaldi G, et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 2005 Jan;21(1):1-26. DOI: 10.1007/s10565-005-0085-6.

7. Щулькин А.В., Транова Ю.С., Абаленихина Ю.В., и др. Клетки линии Сaco-2 как модель для изучения абсорбции лекарственных веществ. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2022;(10):63–69. [Shchulkin AV, Tranova YuS, Abalenikhina YuV, et al. Cells of the Caco-2 line as a model for studying the absorption of medicinal substances. Experimental and Clinical Gastroenterology. 2022;(10):63–69. (In Russ).]. DOI: 10.31146/1682-8658-ecg-206-10-63-69.

8. Pilařová V, Gottvald T, Svoboda P, et al. Development and optimization of ultra-high performance supercritical fluid chromatography mass spectrometry method for high-throughput determination of tocopherols and tocotrienols in human serum. Anal Chim Acta. 2016 Aug 31;934:252–65. DOI: 10.1016/j.aca.2016.06.008.

9. Oliveira DC, Weigch A, Rolim CM. Simple and reliable HPLC analysis of fexofenadine hydrochloride in tablets and its application to dissolution studies. Pharmazie. 2007 Feb;62(2):96–100.

10. Мыльников П.Ю., Черных И.В., Щулькин А.В., Попова Н.М., Якушева Е.Н. ВЭЖХ-методика количественного анализа фексофенадина в печени кроликов. Фармация и фармакология. 2020;8(1):40–47. [Mylnikov PYu, Chernykh IV, Shchulkin AV, Popova NM, Yakusheva EN. HPLC methods of fexofenadine quantitative analysis in rabbits’ liver. Pharmacy & Pharmacology. 2020;8(1):40–47. (In Russ).]. DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-1-40-47.

11. Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Гацанога М.В. Разработка ВЭЖХ-методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2017;(2):35–38. [Yakusheva EN, Chernykh IV, Shulkin AV, Gatsanoga MV. Design of HPLC methods of fexofenadine quantitative analysis in blood plasma. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2017;(2):35–38. (In Russ).].

12. İşleyen EAÖ, Özden T, Özilhan S, Toptan S. Quantitative determination of fexofenadine in human plasma by HPLC-MS. Chromatographia. 2007;(66):109–113. DOI: 10.1365/s10337-007-0267-x.

13. Zhao R, Kalvass JC, Yanni SB, Bridges AS, Pollack GM. Fexofenadine brain exposure and the influence of blood-brain barrier P-glycoprotein after fexofenadine and terfenadine administration. Drug Metab Dispos. 2009 Mar;37(3):529–35. DOI: 10.1124/dmd.107.019893.

14. Flynn CA, Alnouti Y, Reed GA. Quantification of the transporter substrate fexofenadine in cell lysates by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2011 Aug 30;25(16):2361–6. DOI: 10.1002/rcm.5111.