Хемореактомное моделирование эффектов аскорбата, никотината, оксибутирата, комената и карбоната лития

Введение

Соли лития существенно отличаются по своим фармакокинетическим и другим биологическим свойствам, что обуславливает существенные различия в их биодоступности и фармакологическом действии. Неорганические соли (хлорид, карбонат), вследствие сравнительно малых размеров аниона, в принципе не могут проявлять высокоспецифичных взаимодействий с белками протеома или с другими макромолекулами, что и было подтверждено в результате настоящего анализа. В результате, транспорт ионов лития внутрь клетки существенно затруднён и большая часть ионов лития рассеивается в межклеточной жидкости.

В отличие от неорганических солей, соли с органическими анионами (аскорбат, никотинат, оксибутират и др.), способные к более специфическим взаимодействиям с белками, обеспечивают более эффективный транспорт ионов лития внутрь клетки и, кроме того, могут также проявлять специфические эффекты. До настоящего времени, систематического исследования различий в биологических и фармакологических свойствах солей лития и соответствующих анионов не было проведено.

В настоящей работе представлены результаты комплексного сравнительного анализа биологических свойств анионов аскорбата, никотината, оксибутирата и комената с использованием нового направления в постгеномной медицине — хемореактомного моделирования. Оценка эффективности и безопасности потенциальных лекарственных средств на основе их молекулярной структуры является важнейшей задачей  постгеномной медицины. В рамках постгеномной парадигмы, множество всех генов организма данного вида (геном) предоставляет информацию для синтеза всех белков организма (протеом), активность которых приводит к образованию всех метаболитов организма (метаболом) через осуществление всей совокупности химических реакций, протекающих в организме (реактом).

В рамках хемореактомного моделирования принимается, что молекула потенциального лекарственного средства похожа на эндогенные или экзогенные молекулы метаболома и, таким образом, «мимикрирует» под определенные метаболиты (вследствие наличия тех или иных сходств в химической структуре). Связываясь с теми или иными белками протеома, рассматриваемая молекула производит соответствующие данному лекарству эффекты (как позитивные, так и негативные). Совокупность всей имеющейся для заданной молекулы информации о взаимодействии с белками протеома (профиль сродства) позволяет сделать обоснованные выводы о потенциальных эффектах исследуемой молекулы [1].

В данном исследовании был проведён анализ фармакологических «возможностей» химической структуры аскорбата на основе хемоинформационного подхода [2, 3] — т. е. сравнения химической структуры молекулы аскорбата (молекулярной структуры с не-полностью изученными молекулярно-фармакологическими свойствами) со структурами миллионов других молекул, для которых рассматриваемые молекулярно-фармакологические были изучены ранее. Данное сравнение проведено с использованием современных методов анализа данных, которые разрабатываются в научной школе акад. РАН Ю.И. Журавлёва [2—8].

Материалы и методы

Хемоинформатика — область исследований на стыке структурной химии, фармакологии и биоинформатики, в которой взаимосвязи типа «химическая структура» — «свойство вещества» исследуются методами современной информатики. Хемоинформационный анализ позволяет найти молекулы, схожие с исследуемой и, соответственно, предположить физиологические, фармакологические и другие свойства исследуемой молекулы на основе имеющейся информации о свойствах молекул, наиболее близких по структуре.

Особый подраздел хемоинформатики, хемореактомный анализ, направлен на оценку биологических активностей исследуемой молекулы (в частности, моделирование профиля сродства исследуемой молекулярной структуры к различным белкам протеома). В настоящей работе был проведён сравнительный хемореактомный анализ анионов аскорбата, никотината, оксибутирата, комената, карбоната (рис. 1), входящих в состав соответствующих солей лития.

В настоящей работе, для проведения хемо-информационного анализа был применён новый математический метод, основанный на комбинаторной теории разрешимости [2—7]. Комбинаторная теория разрешимости, представляющая собой развитие алгебраического подхода к задачам распознавания, является современным инструментом для исследования признаковых описаний объектов. В случае задачи установления молекул, химическая структура которых схожих с заданной, объектами исследования являются хемографы. Хемограф (χ-граф) — особая разновидность графа (т. е. математического объекта, являющегося как совокупности множества вершин и множества ребер — связей между вершинами). Хемографом называется конечный, связный, неориентированный, размеченный граф без петель, с кликовым числом, не превышающим 3.

В рамках комбинаторной теории разрешимости, χ-графы рассматриваются как объекты, а их инварианты (или кортежи инвариантов) — как признаковые описания объектов. В применении к хемографам, практически важны теорема о полноте кортежей инвариантов произвольного хемографа и теорема соответствия критерия полноты инварианта критерию разрешимости/ регулярности [3], основной результат которых можно записать в следующей форме:

где Pr с Iн х Iк — множество прецедентов графов (полученный из заданного набора молекулярных структур), Iн — множество начальных информаций (вектора iχ), Iк— множество конечных (финальных) информаций, iso(G) — метка, указывающая на принадлежность графа G к некоторому классу изоморфных графов (очевидна из описаний молекулы в базе данных химических структур) в, Iк, χ — множество элементарных χ-инвариантов (фрагментов химической структуры), iχ — кортеж-инвариант (список фрагментов структур, применимый к структуре любой молекулы). Если условие (1) выполнено для заданного множества χ, то χ обеспечивает разрешимость задачи над Pr и позволяет систематически исследовать все фрагменты углеродных скелетов органических молекул. Если множество Pr регулярно, т. е. не содержит двух идентичных хемографов (молекул), то множество χ устанавливается на основе стандартного подхода к вычислению характеристической функции множества информативных значений признаков [3—5, 7] для множества χ, так что Т(α), α ∈ χ определяется на основе выбора элемента кортеж-инварианта (т. е. типа фрагмента углеродного скелета) с наибольшим рангом информативности α:

Данная процедура позволяет найти такой кортеж-инвариант, который бы позволял отличать каждый хемограф (молекулу) в Pr от всех остальных. Тестирование условий (1, 2) проводилось на случайных выборках по 50 000 попарно различных структур молекул из базы данных PubChem [9] с использованием бинарных кортеж-инвариантов над множеством χ-цепей (цепных фрагментов химической структуры) длины n (n=1...7). В результате вычислений было установлено, что при n=7 аккуратность различения одной молекулы от другой составила 99,4% и даже при более коротких длинах х-цепей (n=4,5) достигались довольны высокие показатели аккуратности (93...97%).

С использованием полученного множества χ и метрики Хэмминга, функция расстояния между хемографами dχ над бинарными χ-инвариантами определяется следующим образом:

Данное выражение, отражающее «химическое рас¬стояние» между двумя произвольными молекулами, и было использовано для решения задачи поиска молекул, структурно схожих с аскорбатом.

Таким образом, на первом этапе хемоинформа-ционного анализа с использованием расстояния dх устанавливается список наиболее близких к аскорбату химических структур. На втором этапе, для каждой молекулы из баз данных извлекаются все имеющиеся данные экспериментального измерения различных биологических свойств этой молекулы и проводится хемореактомный анализ.

Хемореактомный анализ направлен на оценки биологических активностей и, прежде всего, моделирование профиля сродства исследуемой молекулярной структуры к различным белкам протеома человека. Профиль сродства необходим для последующего экспертного анализа потенциальных позитивных и негативных эффектов исследуемой молекулы. Элементами множества Iн являются вектора iχ, соответствующие бинарным или численным кортеж-инвариантам хемо-графов, обладающих свойством локальной полноты. При этом, могут использоваться не только тупиковые кортеж-инварианты, полученные в результате комбинаторного тестирования локальной полноты (1, 2), но и кортежи большей мощности (например, включающие все виды элементарных хи-инвариантов, возможные для заданного словаря меток хемографа и найденные в исследованном множестве хемографов и т. д.). Элементами множества являются вектора, соответствующие теоретико-множественным формам профилей сродства (квантильные, вероятностные, ранговые, бинарные).

После вычисления выполнимости условий (1, 2), для каждого из свойств, для которого необходимо рассчитать значения соответствующей константы (константа связывания, константа ингибирования, те или иные экспериментально измеренные свойства молекул и др.) выбираются все схожие молекулы (для которых это свойство было экспериментально измерено) и строится эмпирическая функция распределения значений константы. Представленные в таблицах 2—14 оценки значений различных констант были получены как математическое ожидание и дисперсия соответствующей эмпирической функции распределения, которая использовалась после соответствующей фильтрации посредством i-спектров с образованием непрерывной повсюду дифференцируемой функции и анализа модальности (т. е. числа пиков).

Результаты и обсуждение

С использованием описанного выше метода хемо-информационного анализа были проведены сравнения химической структуры аскорбата с молекулами в базе данных метаболома человека и с молекулами в базах данных лекарственных средств. В качестве модели метаболома человека использовались более 40 000 соединений, приведённых в базе данных HMDB (HumanMetabolomeDatabase, т. е. база данных метаболома человека) [10]. Данные соединения включают большинство соединений, измеряемых в плазме крови человека и, также, ряд лекарственных средств и их метаболитов. В таблице 1 представлены наиболее интересные результаты анализа сходства аскорбата с фармакологически активными веществами.

Анализ сходств химической структуры аскорбиновой кислоты с фармакологически активными веществами указал на сходство аскорбата с много-численными антиоксидантами растительного происхождения, в т. ч. полифенолами черного и зеленого чая, эпигаллокатехинами, флавоноидами. Данные соединения характеризуются антихолестеринемическим, противоопухолевым, антибактериальным и ноотропным действием. Данный результат быт подтвержден и существенно уточнён в результате проведения хемореактомного моделирования.

В процессе проведения хемореактомного моделирования, было проанализировано более 500 000 разновидностей биологических активностей более чем 10 000 000 молекул, информация о которых представлена в базе данных PubChem [9]. Из полученного списка из 4 520 видов биологической активности были выбраны те, отличия в значениях оценок достоверно отличались для аскорбата по сравнению с контрольными молекулами — никотинатом и оксибутиратом. В результате, для аскорбата, никотината, оксибутирата и карбоната лития были получены оценки различных свойств: нейрофизиологических, фармакокинетических, вазоактивных и гемодинамических, противовоспалительный и других.

Хемореактомный анализ нейрофизиологических свойств аскорбата и других анионов

Хемореактомное моделирование показало, что аскорбат-аниону, по сравнению с никотинатом, свойственно большее сродство к серотониновым, дофаминовым, бензодиазепиновым, адренергическим и др. рецепторам (табл. 2). Более высокое сродство к рецепторам, указывает, во-первых, на возможность модуляции активности этих рецепторов аскорбатом лития и, во-вторых, на более интенсивный транспорт аскорбата лития внутрь нейронов (в процессе интернализации рецепторов с поверхности клеточной мембраны).

Анализ указал на более высокое сродство аскорбата к серотониновым рецепторам 5HT1A, 5HT2B, 5НТ6 человека (по сравнению со сродством никотината). Рецепторы типа 5HT1А регулируют широкий круг функций ЦНС, включая агрессию, тревогу, аппетит, артериальной давление, ЧСС, память, ноцицепцию, цикл «сон-бодрствование», терморегуляцию. Рецепторы типа 5HT2B регулируют тревожность, аппетит, моторику ЖКТ, вазоконстрикцию, а рецепторы типа 5НТ6 — тревожность, когнитивные способности, обучение, память [11]. Более высокое ингибирование всасывания 5HTT (Ki=872 нМ, в субмикромолярном диапазоне, характерном для лекарственных средств) указывают на возможные эффекты аскорбата лития как селективного ингибитора обратного захвата серотонина (СИОЗС), которые используются для лечения тревожных расстройств и депрессии.

Более высокое, по сравнению с никотинатом, сродство аскорбат-аниона к рецепторам бензодиазепинов человека указывает на возможные анксилитические эффекты аскорбата. Этот вывод подтверждается результатами моделирования взаимодействия с NMDA-рецепторами и другими глутаматными рецепторами — аскорбат будет способствовать ингибированию активности NMDA-рецепторов NR1a/NR2D (Ki=622 нМ) и метаботропных рецепторов mGluR1a человека (Ki=47 нМ). Глутаматные рецепторы поддерживают процессы возбуждения ЦНС, так что их ингибирование соответствует седативному и анксиолитическому эффекту.

Хемореактомное моделирование эффектов аскорбата с использованием экспериментальных данных указало на возможные эффекты аскорбата лития как более эффективного средства, чем никотинат, в устранении амнезии, вызванной электрошоком в эксперименте у крыс (46%, никотинат — только 1,8%), но и возможную противосудорожную активность (см табл. 2).

Важно отметить, что аскорбат может быть более эффективен, чем никотинат и оксибутират (см. табл. 2) в ингибировании активности фермента GSK3B (аскорбат — 47%, никотинат — 3,3%, оксибутират — 6%) — одного из основных таргетных белков воздействия ионов лития. Константа ингибирования GSK3B (IC50) составила 13,2 нМ для аскорбата, 2 534 нМ для никотината и 1 658 нМ для оксибутирата. Иначе говоря, аскорбат-анион имеет наиболее высокий потенциал ингибирования ГСК-3, а никотинат — наименьший. Данный результат отчасти подтверждается результатами моделирования фосфорилирования GSK3B посредством AKT1 — значение константы ингибирования IC50 составило 3 890 нМ для аскорбата и было выше для никотината (6 835 нМ).

Результаты хемореактомного моделирования эффектов аскорбата в сравнении с оксибутиратом подтверждает приводимые выше результаты и указывает на дополнительные неврофизиологические эффекты аскорбат-аниона. Во-первых, следует отметить выраженный антагонизм аскорбата по отношению к мю-опиоидным рецепторам (полученные оценки значений констант связывания/ингибирования лежат в наномолярном диапазоне, 45...233 нМ), которые участвуют в формировании болезней зависимости. С точки зрения лечения болезней зависимости также важно возможное сродство аскорбата к каннабиоидным рецепторам (Ki=346...652 нМ), бензодиазепиновым рецепторам (Ki=135...343 нМ) и дофаминовым рецепторам (Ki=102...268 нМ, табл. 3).

Хемореактомное моделирование фармакокинетических и фармакодинамических свойств аскорбата

Из фармакологии известно, что аскорбиновая кислота абсорбируется преимущественно в тонкой кишке, TCmax после приёма внутрь — приблизительно 4 ч. С увеличением дозы до 200 мг всасывается до 140 мг (70%); при дальнейшем повышении дозы всасывание уменьшается (50—20%). Связь с белками плазмы — 25%. В норме, концентрация аскорбиновой кислоты в плазме составляет 10.20 мкг/мл [12]. Проведенный анализ позволил получить сравнительные оценки фармакокинетических свойств аскорбата (табл. 4). Прогнозирование свойств аскорбата показало, что при приеме даже высоких доз аскорбата (порядка 10 мг/кг/сут), в отличие от никотината и оксибутирата, не будет происходить существенного изменения гематокрита (связанного с изменениями водно-солевого баланса форменных элементов крови): полученная оценка подразумевает весьма малый процент изменения гематокрита — 3,8%.

Моделирование указало на более низкое сродство аскорбата к калиевому каналу KCNH2 и более слабое ингибирование KCNH2. Данный калиевый канал является важным «антитаргетным» белком, взаимодействие с которым следует избегать во время разработки лекарственных средств [13]. Нарушения активности KCNH2 может привести к смертельно опасному «синдрому длинного QT», чрезвычайно повышающего риск внезапной остановки сердца вследствие спонтанно развивающейся аритмии. Общеизвестно, что многие «клинически успешные» препараты характеризуются, тем не менее, весьма опасной тенденцией к ингибированию KCNH2 (т. е. невысокой безопасностью при высокой клинической эффективности) [14].

По сравнению с оксибутиратом, аскорбат в гораздо меньшей степени может ингибировать микросомальный CYP19 — цитохромный фермент ароматазу (эстроген синтетазу): IC50 аскорбата — 6 714 нМ, оксибутирата — 145 нМ. Ингибирование CYP19 может приводить к нарушениям баланса стероидных гормонов.

Хемореактомное моделирование противовоспалительных, вазоактивных и гемодинамических свойств аскорбата

Результаты моделирования показывают, что аскорбат-анион может характеризоваться более выраженным противовоспалительным действием, чем никотинат или оксибутират (табл. 5). Противовоспалительное действие осуществляется, по всей видимости, за счёт модуляции метаболизма простагландинов (ингибирование таких ферментов, как ЦОГ-2, простагландин G/H синтазы-2, 5-липоксигеназы) и подтверждается результатами моделирования эффектов исследуемых молекул на липополисахарид-индуцированную продукцию ФНО-альфа и др.

Аскорбат-анион, потенциально, проявляет более выраженные вазоактивные и гемодинамические эффекты по сравнению с никотинатом и оксибутиратом (табл. 6). Константы ингибирования аскорбатом ренина (IC50=395 нМ) и рецептора вазопрессина (Ki=145 нМ) находятся в субмикромолярном диапазоне и соответствуют достоверно более высокому сродству к этим рецепторам, в сравнении с контрольными молекулами. Аскорбат-анион также может проявлять умеренный антикоагуляционный, антигиперлипидемический и антигипергликемический эффекты, что также способствует нормализации гемодинамики.

Хемореактомный анализ указал на то, что аскорбат может быть гораздо более эффективен, чем никотинат, оксибутират и карбонат лития в снижении толерантности к глюкозе. Этот антидиабетический эффект, вероятно, осуществляется за счёт связывания и активации PPARy-рецептора — известного таргетного белка для антидибетических средств (например, розиглитазона). Белки рецепторы типа PPAR (активированный рецептор пролифераторов пероксисом) необходимы для переработки избыточного холестерина и снижения уровня сахара в крови. Белки PPAR активируют процессы бета-окисления жирных кислот и агонисты PPAR-y используются при гипергликемии и гиперлипидемии [15, 16].

Сравнительный хемореактомный анализ других свойств аскорбата

Результаты моделирования указывают на возможные противоопухолевые и антимикробные свойства аскорбата лития (табл. 7), которые, в настоящее время, остаются практически неисследованными. Моделирование показало, что аскорбат-анион может проявлять антипролиферативную активность по отношению к различным культурам онкопролиферирующих клеток человека (SK-N-MC, QG56, Н460, НСТ116 и др.).

Как следует, например, из данных в табл. 7, для проявления противоопухолевых свойств необходимы меньшие концентрации аскорбата (константа IC50) по сравнению с никотинатом. Данный эффект прогнозируется для различных линий онкопролифериру-ющих клеток, в т. ч. для нейробластомы (SK-N-MC), карциномы лёгких (QG56, Н460), аденокарциномы толстого кишечника (НСТ116) и др.

Достаточно интересным и неожиданным результатом проведённого моделирования является указание на возможные противомикробные свойства аскорбат-аниона. Например, в сравнении с никотинатом, оценённое значение IC50 против малярийного плазмодия (штамм DD2) составило 41 нМ для аскорбата и 185 нМ для никотината. Также, моделирование указало и на более выраженную противолямблиозную активность (IC50 аскорбата 38 нМ, никотината — 1 134 нМ для Giardiaduodenalis). В сравнении с окси- бутиратом антимикробные свойства аскорбата также Сравнительный анализ хемореактомных профилей аскорбиновой и коменовой кислот

Коменовая кислота, предположительно, может использоваться как лиганд для переноса иона лития внутрь клеток. Как показало сравнение хемореактомных профилей химических структур аскорбата и комената, между этими двумя анионами отмечены достоверные отличия. Во-первых, хемореактомный анализ показал, что коменат, по всей видимости, не обладает рядом биологических активностей, характерных для аскорбата (табл. 8). Во-вторых, были установлены достоверные различия между аскорбатом и коменатом в ряде констант биологических активностей (табл. 9).

Для аскорбата характерны противовоспалительное действие за счет модуляции метаболизма простагландинов, ингибирование NМDA рецепторов (что вносит определенный вклад в снижение гипервозбудимости нервной системы), противогликемическое действие (агонист PPAR-рецепторов). Данные эффекты отсутствуют в хемореактомном профиле комената (см. табл. 8).

Анализ достоверных различий показал, прежде всего, что коменат в значительно меньшей степени способен ингибировать фермент GSK3-6ema-Kma3y (табл. 9). Таким образом, в отличие аскорбата, коменат не обладает столь выраженным синергизмом по отношению к одному из основных механизмом молекулярного действия ионов лития, важного для реализации нейропротекторного эффекта, как ингибирование GSK3. Антиоксидантная активность комената также несколько ниже, чем для аскорбата (табл. 9).

Заключение

Впервые проведено хемореактомное моделирование эффектов аниона аскорбата в сравнении с контрольными молекулами (никотинатом, оксибутиратом, коменатом и карбонатом) — анионами, использующимися для транспорта ионов лития внутрь клеток. В соответствии с результатами моделирования, аскорбат-аниону свойственно большее сродство к серотониновым, дофаминовым, бензодиазепиновым, адренергическим рецепторам по сравнению с контрольными молекулами. Более высокое сродство аскорбат-аниона к этим рецепторам, указывает, во-первых, на возможность модуляции активности этих рецепторов аскорбатом лития и, во-вторых, на более интенсивный транспорт аскорбата лития внутрь нейронов и других клеток ЦНС. Более высокое, по сравнению с никотинатом, сродство к рецепторам бензодиазепинов человека указывает на возможные анксиолитические эффекты аскорбата. В отличие аскорбат-аниона, контрольные молекулы не обладают столь выраженным синергизмом по отношению к одному из основных механизмом молекулярного действия ионов лития, важного для реализации нейропротекторного эффекта — ингибированию фермента киназы-3 гликогенсинтетазы (GSK3). В соответствии с результатами анализа исследованные контрольные молекулы, по сравнению с аскорбатом, характеризуются меньшей биодоступностью, меньшим всасыванием в ЖКТ, меньшей растворимостью в воде и более низким антиоксидантным действием. Аскорбат-анион может характеризоваться выраженным противовоспалительным действием, обусловленным модуляцией метаболизма простагландинов и проявлять умеренный антикоагуляционный, антигиперлипидемический и антигипергликемический эффекты, что также способствует нормализации гемодинамики. Сравнение с результатами хемореактомного моделирования карбонат-аниона показало, что карбонат анион не обладает ни одним из вышеперечисленных свойств аскорбат-аниона.