Димерные дипептидные миметики 3-й и 4-й петель фактора роста нервов активны на модели ишемического инсульта

Введение

За последние десятилетия накоплено множество данных, подтверждающих высокий терапевтический потенциал фактора роста нервов (NGF — nerve growth factor) для лечения ряда нейродегенеративных и других заболеваний, в частности ишемического инсульта. На основе разных подходов во всём мире предпринимаются попытки преодоления ограничений применения NGF в клинике, связанные с его белковой природой.

В НИИ фармакологии имени В. В. Закусова были сконструированы и синтезированы димерные дипептидные миметики наиболее экспонированных наружу участков в-изгибов 4-й и 3-й петель NGF, соответственно гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) (рабочий шифр ГК-2) и гексаметилендиамид бис-(N-гамма-оксибутирил-L-лизил-L-гистидина) (рабочий шифр ГТС-115) [1, 2].

Ранее было установлено, что оба миметика проявлют нейропротекторную активность in vitro в микронаномолярных концентрациях на модели окислительного стресса в культуре гиппокампальных нейронов HT-22 [2, 3]. Методом Вестерн-блот анализа было показано, что оба соединения активируют специфичные для NGF TrkA рецепторы, но имеют разную картину активации пострецепторных сигнальных путей: ГТС-115 активирует оба основные TrkA пострецепторные сигнальные пути, MAPK/ERK и PI3K/AKT (неопубликованные данные), а ГК-2 селективно активирует PI3K/AKT путь [4].

Целью данной работы являлось сравнительное изучение фармакологических эффектов димерных дипептидных миметиков 4-й и 3-й петель NGF на модели ишемического инсульта, вызванного транзиторной окклюзией средней мозговой артерии у крыс.

Материалы и методы

Материалы и реактивы. Дипептиды ГК-2 (гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина)) и ГТС-115 (гексаметилендиамид бис-(N-гамма-оксибутирил-L-лизил-L-гистидина)) были синтезированы в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова. Хлоралгидрат был получен в фирме Merck and Co., Inc. (USA). Трифенилтетразолий-2,3,5 хлорид (ТТХ) был получен в компании Sigma-Aldrich (USA).

Животные. Эксперименты были проведены на беспородных крысах-самцах массой 250—290 г на момент начала эксперимента, полученных из Государственного предприятия Питомника лабораторных животных «Столбовая» при РАМН. Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к корму и воде. При работе с крысами соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.

Моделирование ишемического инсульта. Ишемический инсульт моделировали внутрисосудистым перекрытием средней мозговой артерии нитью по методике, впервые описанной E.Z. Longa et al. (1989) [5]. Крыс наркотизировали 5% раствором хлоралгидрата (350 мг/кг, внутрибрюшинно), выполняли срединный разрез в области шеи и выделяли правые общую сонную артерию, внешнюю сонную артерию и внутреннюю сонную артерию. Накладывали лигатуры на внешнюю и внутреннюю сонные артерии и микрососудистую клипсу на общую сонную артерию. После этого перерезали внешнюю сонную артерию дистальнее лигатуры. Гепаринизированную нейлоновую нить диаметром 0,25 мм, покрытую силиконом, вводили через культю внешней сонной артерии на глубину 19—20 мм, до перекрытия средней мозговой артерии и фиксировали клипсой. Перекрытие кровотока осуществляли в течение 1 ч, после чего нить извлекали. Ложнооперированные животные подвергались тем же процедурам, что и оперированные, за исключением перерезания сосудов и введения нити.

Дизайн исследования. Оперированных животных случайным образом делили на 2 группы. Животным первой группы через 4 ч после операции, а затем раз в сутки в течение 6 дней внутрибрюшинно (в/б) водили ГК-2 (0,5 мг/кг) или ГТС-115 (1 мг/кг), растворённые в дистиллированной воде из расчёта 2 мл/кг. Выбор дозы исследуемых соединений был осуществлён на основании предварительных экспериментов. Ложнооперированные и оперированные нелеченые животные получали в/б дистиллированную воду. Массу тела крыс измеряли перед операцией, а также на 3-и и 7-е сутки после операции. На 7-е сутки животных декапитировали и определяли объём инфаркта с помощью анализа отсканированных изображений срезов мозга, окрашенных ТТХ. Фармакологические свойства ГК-2 и ГТС-115 были изучены в отдельных экспериментах.

Определение объёма инфаркта. Для оценки объёма инфаркта мозга животных под глубоким наркозом (хлоралгидрат, 350 мг/кг, в/б) декапитировали, головной мозг извлекали и замораживали при —20 °С в течение 15 мин. Затем мозг нарезали на 5 фронтальных срезов по 1,7 мм толщиной. Срезы головного мозга окрашивали в 2% растворе ТТХ в фосфатном буфере при температуре 37 °С в течение 20 мин. Окрашенные срезы затем фиксировали в 10% растворе формалина, помещали на предметные стекла и сканировали с обеих сторон с разрешением 2 400 dpi на сканере LaserJet M1212nf MFP. Анализ цифровых изображений проводили с помощью свободно распространяемой программы анализа медицинских изображений Image J. Объём инфаркта (V) определяли по формуле: V = 1,7 х£ Si/2, где SSi — сумма площадей области повреждения (неокрашенные участки) на срезах.

Статистика. Межгрупповые различия оценивали с помощью U критерия Манна-Уитни. Данные представлены в виде средних и стандартных ошибок среднего. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

В табл. 1 показана гибель животных в течение 7 суток после операции. Статистически достоверных межгрупповых различий по данному параметру выявлено не было.

У оперированных нелеченых животных наблюдалась выраженная область повреждения в правом полушарии головного мозга. По результатам эксперимента с ГК-2 морфометрии срезов мозга, окрашенных ТТХ, объём зоны некроза составлял 250-300 мм3. Оба исследуемых соединения — ГК-2 и ГТС-115 — вызывали значительное снижение объёма повреждения мозга по сравнению с оперированными нелечеными животными. ГК-2 (0,5 мг/кг/сутки, в/б, 7 сут) снижал объём повреждения на 35% (рис. 1) и ГТС-115 (0,5 мг/ кг/сутки, в/б, 7 суток) — на 25% (рис. 2).

Таким образом, выраженность нейропротекторных эффектов миметика 4-й петли NGF ГК-2 была выше, чем у миметика 3-й петли NGF ГТС-115. Эти данные согласуются с результатами, ранее получнными invitro. Дипептид ГК-2 проявлял нейропротекторную активность на модели окислительного стресса в культуре гиппокампальных нейронов HT-22 в концентрациях 10-5-10-9 [3], а ГТС-115 в тех же условиях был активен в концентрациях 10-5-10-8 М [2]. Выраженность нейропротекторных эффектов у ГК-2 была выше, чем у ГТС-115 в соответствующих концентрациях. Это можно объяснить разным вкладом 3-й и 4-й петель NGF в нейропротекцию.

Из литературы известно, что нейропротекторная активность нейротрофинов, в частности NGF, опосредована в основном PI3K/AKT путём [6]. MAPK/ ERK путь отвечает за дифференцирующую активность, а в случае с NGF вовлечён в развитие гиперальгезии [7]. Таким образом, миметик 4-й петли NGF, селективно активирующий PI3K/AKT сигнальный путь, обладает более предпочитетельными фармакологическими характеристиками, чем ГТС-115, активирующий PI3K/AKT и MAPK/ERK пути.

На основании полученных в данной работе результатов димерный дипептидный миметик 4-й петли NGF ГК-2 был отобран для дальнейшего изучения в качестве потенциального нейропротекторного средства для лечения острых нарушений мозгового кровообращения.

Выводы

Установлено, что димерные дипептидные миметики 3-й и 4-й петель NGF обладают NGF-подобной нейропротекторной активностью на модели ишемического инсульта, вызванного транзиторной окклюзией средней мозговой артерии у крыс. При этом активации PI3K/AKT сигнального пути достаточно для проявления этой активности. Наиболее активный миметик 4-й петли NGF ГК-2 был отобран для дальнейшей разработки в качестве потенциального лекарственного средства.