Поиск селективных блокаторов цинк-зависимых металлопротеиназ 2-го и 9-го типа в ряду бензоиламино(фенилсульфонил)-замещенных циклических аминокислот

Введение

Известно, что в условиях острого трансмурального инфаркта миокарда в результате гибели большого количества сократительных кардиомиоцитов в ишемизированном миокарде происходит существенная структурная перестройка, приводящая к значительным изменениям размеров, геометрии и функции левого желудочка сердца. Этот патологический процесс хорошо изучен как в эксперименте [9, 13, 20], так в клинике [6, 10, 19] и носит название «ранее постинфарктное ремоделирование сердца». Полагают, что одну из ключевых ролей в этом процессе играют матриксные металлопротеиназы (ММП) — энзимы, вовлекающие межклеточный матрикс миокарда в процесс структурно-функционального ремоделирования посредством деградации цепей коллагена [7, 18]. В этом плане наибольший интерес представляют цинк-зависимые матриксные металлопротеиназы 2-го и 9-го типов (желатиназы) — ММП-2 и ММП-9, поскольку известно, что, с одной стороны, они имеют тропность к коллагену I и III типа, составляющему основу межклеточного матрикса миокарда, а с другой стороны, показано, что находящийся в очаге ишемии коллаген подвергается конформационным изменениям, в результате чего его трёхмерная спираль начинает «раскручиваться», и он переходит в одномерную фрагментированную цепочку, представляющую собой желатин, который и является акцептором действия ММП-2 и ММП-9 [1, 17]. Не менее важно и то, что эти ММП, помимо внеклеточной, имеют и внутриклеточную локализацию, в том числе на мембранах саркоплазмотического ретикулума и митохондрий, а также в ядре клетки [11, 14, 16]. Недавно выполненные исследования свидетельствуют о том, что эти ферменты имеют внутри клеток специализированные протеолитические цепи и в условиях ишемии под влиянием оксидативного стресса активируются в течение нескольких секунд от момента её начала [12], что даёт основание полагать, что они (ММП) играют важную роль в развитии раннего этапа сократительной дисфункции повреждённых ишемией кардиомиоцитов [3].

В последние годы проводятся достаточно интенсивные исследования по поиску и внедрению в широкую клиническую практику лекарственных средств, селективно блокирующих гиперактивность ММП-2 и ММП-9 в ишемизированном миокарде [5], однако эта проблема все ещё далека от своего окончательного разрешения.

Цель исследования

Целью работы является поиск оригинальных биологически активных соединений, потенциально обладающих способностью блокировать активность ММП-2 и ММП-9, в ряду новых представителей бензоиламино(фенилсульфонил)-замещённых циклических аминокислот общей формулы (рис. 1), поскольку эти соединения отвечают всем основным требованиям фармакофорной модели строения ингибиторов ММП-2 и ММП-9.

Материалы и методы

Животные

Все включённые в исследование животные были получены из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», филиал «Столбовая». Животные содержались в стандартных условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» при контролируемом освещении (12 ч — свет/12 ч — темнота) и постоянной температуре (21—23 °C) со свободным доступом к воде и брикетированному корму в течение 10 сут до начала тестирования. Условия содержания животных соответствовало приказу МЗ РФ № 708н «Об учреждении правил лабораторной практики» от 23.08.2010 г. и этическим нормам, изложенным в Правилах лабораторной практики (GLP) Хельсинкской декларации (2 000).

Изучение влияния изучаемых соединений на уровень металлопротеиназы-9 в плазме крови крыс с острым инфарктом миокарда

Опыты проводили на беспородных крысах-самцах массой 200 -220 г. Животные были рандомизированы на 10 групп по 6 особей в каждой: 1-я — интактная, 2-я — контрольная — инфаркт миокарда, 3-я — инфаркт миокарда + эталонный препарат доксициклин, 4-10-я — группы, получавшие исследуемые соединения, соответственно, 1а, 1в, 1ж, 1з, 11а, 11в. Анестезированных (уретан 1 300 мг/кг, в/б) животных интубировали и переводили на искусственное дыхание. После торако- и перикардотомии идентифицировали левую коронарную артерии и производили её одномоментную перевязку на уровне выхода сосуда из-под ушка сердца. Эталонный препарат доксициклин (40 мг/кг/сут) и исследуемые соединения в дозе 30 мг/кг/сут вводили внутрижелудочно через зонд в 0,5 мл физиологического раствора в течение 3 дней, предшествующих эксперименту. Через 3 ч после перевязки коронарной артерии животных забивали, а кровь забирали для иммуноферментного определения уровня в плазме ММП-9. Определение уровня МПП-9 проводили с помощью автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора «Chem Well 2910 Combi», США. В работе использовали набор для иммуноферментного определения ММР-9 крысы RMP900 (R&D Systems, США). Статистическую обработку результатов проводили следующим образом: нормальность распределения выборок проверяли с помощью критерия Шапиро Уилка, гомогенность дисперсий — критерия Левена. Так как выборки имели нормальное и близкое к нему распределение и дисперсии были гомогенны, для определения статистической значимости различий использовали однофакторный дисперсионный анализ с последующей обработкой с помощью метода множественных сравнений по Ньюмену Кейлсу. Результаты выражали в виде средних арифметических и их стандартных ошибок.

Изучение влияния соединения — лидера на ремоделирование миокарда в острейшую фазу экспериментального инфаркта миокарда

Опыты проводили на беспородных крысах-самцах массой 450-500 г, наркотизированных уретаном (1 300 мг/кг, в/б). Животных рандомизировали на четыре группы: 1-я — ложнооперированные (n=6); 2-я — контроль = острый инфаркт миокарда (n=12); 3-я — доксициклин + острый инфаркт миокарда (n=9); 4-я — соединение-лидер (Iа) + острый инфаркт миокарда (n=6). Экспериментальный инфаркт миокарда воспроизводили по методу Селье. После торако- и перикардотомии под переднюю ветвь левой коронарной артерии на 0,5—1 мм ниже её выхода из-под ушка сердца проводили лигатуру. У ложнооперированных животных лигатура оставалась под коронарной артерией на протяжении всего эксперимента, а у животных 2-й, 3-й и 4-й групп производили одномоментную перевязку коронарной артерии. Величину ремоделирования миокарда в 1-й и 2-й группах и влияние на неё изучаемых соединений оценивали при помощи эхокардиографии, как было описано ранее [2]. Животным 3-й группы внутрижелудочно через зонд вводили доксициклин (40 мг/кг/сут в 0,5 мл физиологического раствора) в течение 3 дней, предшествующих эксперименту. Животным 4-й группы по аналогичной схеме и в том же объёме растворителя вводили соединение-лидер (30 мг/кг/сут). Животные 1-й и 2-й групп по аналогичной схеме получали 0,5 мл физиологического раствора. Статистическую обработку данных производили следующим образом: нормальность распределения выборок определяли с помощью критерия Шапиро Уилка. Так как выборки имели нормальное распределение, для определения статистической значимости изменений использовали однофакторный дисперсионный анализ и дисперсионный анализ повторных измерений с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Ньюмену Кейлсу. Различия считали значимыми при p≤0,05. Данные в таблице представлены в виде средних арифметических и их стандартных ошибок, а в тексте и фигурах — только в виде средних арифметических.

Результаты и обсуждение

Анализ результатов изучения влияния бензоила-мино(фенилсульфонил)-замещённых циклических аминокислот на уровень ММП-9 в крови в условиях ишемии миокарда свидетельствует о том, что только соединение 1а значимо (р=0,022) по сравнению с контролем понижает этот показатель (рис. 2) и по своей активности, как минимум, не уступает эталонному препарату доксициклину. Выбор доксициклина в качестве эталонного препарата основан на том, что тетрациклины, в частности доксициклин, помимо собственно антибактериальной активности, обладают рядом плейотропных эффектов, в том числе и способностью блокировать гиперпродукцию ММП-2 и ММП-9 в ишемизированном миокарде и тем самым препятствовать раннему постинфарктному ремоделированию миокарда [4, 8]. Не менее важно и то, что доксициклин является первым лекарственным средством, обладающим свойствами ингибитора ММП, которое было разрешено FDA к применению в клинике по этим показаниям [15].

В следующей серии экспериментов оценивали способность соединения-лидера (1а) препятствовать ремоделированию миокарда в острейшую фазу экспериментального инфаркта миокарда. Показано, что одномоментная перевязка коронарной артерии в контрольной группе животных повлекла за собой выраженные изменения систолической функции левого желудочка. На третьей минуте после окклюзии коронарного сосуда конечно-систолический размер (КСР) левого желудочка увеличился с 1,98 до 3,11 мм; фракция выброса (ФВ) уменьшилась с 88,40 до 67,00%. Фракция укорочения (ФУ) снизилась с 53,17 до 32,27%. Этот процесс динамически нарастает во времени и достигает своего максимума в период с 10-й по 20-ю минуту после перевязки. Так, например, к 20-й минуте КСР увеличился с 1,98 до 3,84 мм, а ФВ уменьшилась с 88,4 до 58,0%. В период с 30-й по 60-ю минуту от момента перевязки коронарной артерии отмечено постепенное относительное улучшение показателей, характеризующих систолическую функцию левого желудочка, однако все они статистически значимо отличались от исходного уровня (табл. 1).

В группе животных (n=9), получавших доксициклин (40 мг/кг, per os), одномоментная перевязка коронарной артерии также влекла за собой снижение систолической функции левого желудочка сердца, однако в первые 20 мин от момента начала ишемии интенсивность этого процесса была статистически значимо ниже (табл. 1, рис. 3, 4). Так, например, к 20-й минуте ишемии у контрольных животных КСР увеличивался с 1,98 до 3,84 мм, т. е. практически в 2 раза, тогда как у животных, получавших доксициклин, увеличение КСР составило менее 60% (соответственно, с 1,77 до 2,80 мм) — различия статистически значимы (p=0,004) (табл. 1, рис. 3). К этому моменту у контрольных животных ФВ снизилась с 88,4 до 58,0%, т. е. на 34%, а у животных, получавших доксициклин — менее чем на 25% (соответственно, с 91,4 до 69,5%) — различия статистически значимы (р=0,002) (табл. 1, рис. 4). Начиная с 30-й минуты ишемии, показатели, характеризующие систолическую функцию левого желудочка сердца, в группе животных, получавших доксициклин, статистически значимо не отличались от таковых, зарегистрированных в это же время в контрольной группе.

В группе животных (n=6), получавших соединение 1а (30 мг/кг, per os), одномоментная перевязка коронарной артерии, так же как в контроле и в группе животных, получавших доксициклин, влекла за собой снижение систолической функции левого желудочка сердца, однако в первые 20 минут от момента начала ишемии интенсивность этого процесса была статистически значимо ниже, чем в контроле (табл. 1, рис. 2-3). Так, например, к 20-й минуте ишемии у контрольных животных КСР увеличивался с 1,98 до 3,84 мм, т. е. практически в 2 раза, тогда как у животных, получавших соединение 1а, увеличение КСР составило, так же, как и в случае доксициклина, менее 60% (соответственно, с 1,84 до 2,87 мм), различия статистически значимы (p=0,007) (табл. 1, рис. 2). К этому моменту у контрольных животных ФВ снизилась с 88,4 до 58,0%, т. е. на 34%, а у животных, получавших соединение 1а — менее чем на 25% (соответственно, с 90,5 до 68,9%) — различия статистически значимы (р=0,001) (табл. 1, рис. 3). Если различия в показателях, отражающих систолическую функцию сердца в период максимального падения сократимости миокарда (10-20-я минуты ишемии) между контрольной группой и группой животных, получавших соединение 1а, статистически значимы, то различия в величине КСР и ФВ между группами, получавшими доксициклин и соединение 1а, практически отсутствуют: соответственно р=0,840 и р=0,587.

Таким образом, в ряду бензоиламино(фенил- сульфонил)-замещённых циклических аминокислот выявлено соединение — лидер: 1-({4-[(4-хлорбензо- ил)амино]фенил}сульфонил-L-пролин, — которое по своей способности как препятствовать раннему постинфарктному ремоделированию миокарда, так и подавлять экспрессию ММП-9, как минимум, не уступает эталонному ингибитору металлопротеиназ доксициклину. Полученные данные составляют основу для дальнейшего фармакологического изучения соединения-лидера.