Влияние интраназального и внутрибрюшинного введений пептидов Семакса и Ноопепта на поведенческие характеристики мышей BALB/c

Введение

Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) и ноопепт (этиловый эфир N-фенилацетил-L-пролилглицина) относятся к ноотропным средствам пептидной природы, проявляющим также нейропротективные и анксиолитические свойства. Несмотря на общность фармакологических эффектов, эти препараты имеют различия в фармакокинетике и фармакодинамике, проявляют специфические для каждого свойства. Следует также отметить, что семакс в клинике назначается в виде назальных капель, а ноопепт — в виде таблеток.

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что инбредные мыши линии BALB/c характеризуются в сравнении с особями инбредной линии C57BL/6 меньшей эффективностью исследовательского поведения, большей тревожностью и двигательной активностью в условиях незнакомой обстановки крестообразного лабиринта, поэтому именно они были выбраны в данной работе как модель когнитивного дефицита и/или состояния повышенной тревожности и двигательной активности [1]. Кроме того, нами было выявлено, что семакс и ноопепт при внутрибрюшинном введении вызывают у мышей BALB/c не только повышение эффективности исследовательского поведения (ноотропный компонент), но и снижают тревожность (анксиолитический компонент) [2, 3].

В связи с вышесказанной целью настоящего исследования стало сравнение ноотропных и анксиолитических эффектов пептидов семакса и ноопепта при внутрибрюшинном и интраназальном путях введения на мышах BALB/c.

Материалы и методы 

Исследования проводили на самцах мышей линий BALB/c массой 25—30 г, которых содержали в виварии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму ad libitum, по 15 особей в клетке в течение 1-й недели до начала эксперимента, на стандартной диете при 12-часовом световом режиме. Животным посредством внутрибрюшинных и интраназальных инъекций в течение 5 дней (субхроническое введение) один раз в сутки вводили физиологический раствор (контрольная группа — NaCl, 0,9%), либо препараты, растворённые в физ. растворе (опытные группы).

В эксперименте использовали следующие дозы препаратов: семакс — 0,6 мг/кг/день (Отдел химии физиологически активных веществ Института молекулярной генетики РАН), ноопепт — 1 мг/кг/день (ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»). Препараты применяли в дозах, эквипотенциальных по антиамнестическому эффекту в тесте условной реакции пассивного избегания (УРПИ) и в экспериментах по микродиализу [4].

Для оценки характера влияния исследуемых ноотропных веществ на спонтанную ориентацию, тревожность, двигательную активность — реакцию на новизну обстановки, как часть высших интегративных процессов, использовали тест закрытого крестообразного лабиринта (ЗКЛ). Данный метод является не инвазивным и основан на врождённой способности каждого животного к различной степени эффективности исследовательского поведения в новой обстановке. Закрытый крестообразный лабиринт состоял из 4 пластмассовых закрытых пустых отсеков, соединенных с центральным отсеком с помощью входных отверстий. Мышь помещали в центральный отсек лабиринта и в полуавтоматическом режиме с помощью программы Bеhаviour регистрировали последовательность и продолжительность её переходов из одного рукава в другой. Последующий анализ данных позволял выделить ряд показателей эффективности исследовательского поведения, тревожности и двигательной активности [5].

Показатели величины 1-го цикла патрулирования (F_PtrN) и числа циклов патрулирования (PatrN) используются для оценки ноотропного действия веществ [6, 7]: чем больше число заходов требуется мыши, чтобы посетить все 4 боковых рукава (совершить один цикл патрулирования), тем менее «систематично» и менее эффективно исследование лабиринта. Число циклов патрулирования, совершённых за время эксперимента, ещё один показатель эффективности исследовательского поведения. Чем больше циклов патрулирования, тем более «систематично» и более эффективно исследование лабиринта животным.

Латентный период (F_ChTm) и продолжительность 1-го визита в боковой отсек (F_GITm) — показатели, которые отражают уровень тревожности животного в новой обстановке и могут рассматриваться как показатель баланса между любопытством и тревогой животного в новой обстановке [8—10], и быть использованы для оценки транквилизирующего (анксиолитического) эффекта веществ [11]. Эти показатели отрицательно коррелируют с продолжительностью пребывания животного в открытых рукавах в общепризнанном тесте открытого приподнятого лабиринта, что позволяет использовать избирательное изменение этих показателей в качестве индикатора тревожности [12, 13].

Общее время, проведённое животным в центральном и боковых отсеках лабиринта (T_ChTm и T_GITm) — это показатели, которые отражают уровень двигательной активности, а также характеризуют интенсивность обследования новой среды и могут быть использованы для оценки стимулирующего (тимолептического) или наоборот седативного эффекта веществ [9, 14].

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Statistica 6.0. с привлечением методов параметрической и непараметрической статистики (1-тест Стьюдента, тест Манна-Уитни, критерий Колмогорова-Смирнова, тест Вальда-Вольфовица). На графиках представлены средние значения с учётом стандартной ошибки среднего (теап±8.Е.М).

Результаты и обсуждение

Регуляторные пептиды относятся к универсальным эндогенным биорегуляторам функций клеток в организме человека, важную роль среди них играют нейропептиды — регуляторы функций нервной системы. Каждый регуляторный пептид имеет спектр биологической активности, который определяется его взаимодействием с клеткой-мишенью, а также свойством индуцировать высвобождение ряда других пептидов, являющихся индукторами высвобождения следующей группы пептидов и т. д., вследствие чего первичные эффекты того или иного пептида пролонгируются и развиваются в организме [15].

Семакс — лекарственный препарат, являющийся регуляторным пептидом, обладающий ноотропным, нейропротекторным, антиоксидантным и антигипоксическим действиями [16]. Представляет собой модифицированный фрагмент белкового адренокортикотропного гормона (АКТГ), содержащий семь аминокислотных остатков, поэтому и действует на организм, как его собственный нейропептид [17]. Помимо всех перечисленных свойств обладает также анксиолитическим эффектом [2, 18].

Ноопепт — лекарственный препарат, обладающий ноотропным и нейропротективным действием, проявляющий выраженную мнестическую и антиамнестическую активность в значительно меньших дозах по сравнению с другими ноотропами (в 1 000 раз меньших, чем для пирацетама), являющийся малотоксичным соединением и не имеющий побочных эффектов [19]. В отличие от применяющихся пептидов в структуру ноопепта входят всего 2 аминокислоты. Ноопепт улучшает способность к обучению, память, действуя на все фазы процессинга: начальную обработку информации, консолидацию, извлечение. Ноотропный эффект препарата связан с образованием циклопролилглицина, аналогичного по структуре эндогенному циклическому дипептиду обладающему антиамнестической aктивнocтью, a также c наличием хoлинoпoзитивнoгo действия [19, 20, 21].

СЕМАКС. В настоящем исследовании при внутрибрюшинном введении семакса параметр F_PtrN уменьшился на 16% по сравнению с контрольными значениями (F_PtrN(семакс) = 4,79±0,19), PatrN увеличился на 10% (PtrN(семакс) = 2,07±0,07), F_ChtM уменьшился на 57% (F_ChtM= 5,27±0,64), F_GITm снизился на 35% (F_GITm(семакс)= 5,90±0,51). При интраназальном введении семакса изменения по сравнению с контролем были следующими: F_PtrN уменьшился на 15% (F_PtrN(семакс)= 7,81±0,43), PatrN увеличился на 36% (PatrN(семакс) = 1,50±0,09), F_GITm уменьшился на 40% (F_GITm(семакс) = 14,10±2,93), T_ChTm уменьшился на 22% (T_ChTm(семакс) = 54,87±2,15), T_GITm уменьшился на 5% (T GITm(семакс) = 88,82±2,86). Следовательно, при внутрибрюшинном введении семакса улучшается исследовательская активность мышей и понижается тревожность, но в свою очередь при интраназальном введении в большей степени возрастает эффективность исследовательского поведения по сравнению с внутрибрюшинным (p<0,05, t-тест Стьюдента), в меньшей степени проявляется анксиолитический эффект препарата (p<0,05, t-тест Стьюдента), а также увеличивается двигательная активность.

НООПЕПТ. В случае внутрибрюшинного введения ноопепта PatrN увеличился на 2% по сравнению с контрольными значениями (PatrN(ноопепт) = 1,92±0,08), F_ChTm уменьшился на 47% (F_ChTm(ноопепт) = 5,73±1,33), F_GITm снизился на 28% (F_GITm(ноопeпт) = 6,50±1,15). При назальном введении ноопепта величина F_PtrN уменьшилась на 29% (F_PtrN(ноопeпт)= 5,00±0,21), а F_GITm - а 34% (F_GITm(ноопепт) = 11,03±1,27). Таким образом, у ноопепта при внутрибрюшинном введении улучшается исследовательская активность мышей и понижается тревожность, тогда как при интраназальном введении сильнее возрастает эффективность исследовательского поведения (p<0,05, p-тест Стьюдента) и слабее выражаются анксиолитические свойства (p<0,05, p-тест Стьюдента) по сравнению с внутрибрюшинным.

Результаты поведенческого тестирования в ЗКЛ мышей BALB/c после внутрибрюшинного и интраназального введений семакса в дозе 0,6 мг/кг/день и ноопепта в дозе 1 мг/кг/день представлены на рис. 1. На верхних панелях (а, в) расположены результаты внутрибрюшинного введения, на нижних (б, г) — интраназального.

Таким образом, на основании сопоставления полученных результатов можно выделить общие свойства пептидов семакса и ноопепта при разных путях введения: при внутрибрюшинном введении оба препарата сильнее проявляют свои анксиолитические свойства, а при интраназальном — ноотропные.

Внутрибрюшинный путь введения лекарственных средств по скорости воздействия приближается к внутривенному, но в клинических условиях он используется редко. Висцеральный листок брюшины, богатый кровеносными сосудами, выделяет в полость серозную жидкость, а париетальный листок, за счёт лимфатических сосудов, её всасывает. Предполагается, что лекарственное вещество, введённое внутрибрюшинно, попадает в лимфатическую систему, протоки которой впадают в грудные вены большого круга кровообращения, последние в свою очередь переходят в систему верхней полой вены, заканчивающую свой путь в правом предсердии [22, 23].

При интраназальном введении веществ значительная их часть всасывается в кровь, меньшая — при помощи периневрального транспорта по чувствительным нервам попадает непосредственно в мозг через нейроны обонятельного тракта и далее распространяется по структурам головного мозга при помощи механизмов, не связанных с кровотоком, при этом отсутствует пресистемный метаболизм в желудочно-кишечном тракте и печени, быстрее достигается терапевтический эффект, то есть присутствует возможность прямого поступления лекарств непосредственно в мозг. Механизмы, участвующие в доставке веществ из носовой полости в мозг, изучены недостаточно, но известно несколько путей: внутриклеточный аксональный транспорт по обонятельному нерву, по поддерживающим эпителиальным клеткам, экстранейрональный транспорт вдоль обонятельного нерва [33]. Используемым пептидам, вероятно, более присущ экстранейрональный транспорт вдоль обонятельного нерва, посредством которого короткие пептидные молекулы могут попадать напрямую в нервную ткань по межклеточному пространству через щелевые контакты между поддерживающими клетками и обонятельными нейронами [24, 25].

Полученную разницу в соотношении ноотропного и анксиолитического компонентов при внутрибрюшинном и интраназальном введении ноопепта и семакса можно интерпретировать с нескольких точек зрения.

При разных путях введения у препаратов может наблюдаться различная биотрансформация, следовательно, образующиеся метаболиты могут проявлять неодинаковые фармакологические эффекты.

Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) распадается в сыворотке крови крыс под воздействием аминопептидаз и ангиотензин-преобразующего фермента [26]. Первым отщепляется метионин в положении 1, оставляя гексапептид (Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), затем глутамин в положении 2 (His-Phe-Pro-Gly-Pro). Эти фрагменты являются стабильными нейропептидами, самостоятельно модулирующими холинергическую нейропередачу и генерацию оксида азота [16, 27]. Кроме того, под влиянием аминопептидаз семакс может метаболизироваться в тетрапептид Met-Glu-His- Phe и трипептид Pro-Gly-Pro, оказывающие влияние на функциональную активность нервной клетки [28, 29]. Дальнейший распад всех пептидов продолжается до отдельных аминокислот, которые как абсолютно естественные для организма включаются в обменные процессы [26].

Ноопепт (этиловый эфир N-фенилацетил-L-пролилглицина), абсорбируясь в желудочно-кишечном тракте, в неизменённом виде поступает в системный кровоток, проникает через гематоэнцефалический барьер, определяется в мозге в больших концентрациях, чем в крови. Пептид частично сохраняется в неизменённом виде, частично метаболизируется с образованием фенилуксусной кислоты, фенилацетилпролина и циклопролилглицина (цПГ). Последний, являясь основным метаболитом ноопепта, обладает структурным сходством с эндогенным нейропептидом [30]. Неизменённый ноопепт обнаруживается в малых количествах в сыворотке, поскольку он быстро метаболизируется в течение 25 мин после перорального приёма. Кроме того, цПГ сам по себе имеет ноотропный потенциал при введении в форме инъекций, хотя в меньшей степени, чем ноопепт [31]. В настоящее время считается, что ноопепт действует в качестве пролекарства для цПГ, и именно в этой форме цПГ проявляет большую активность. Однако существуют данные, что при приёме ноопепта в виде инъекций и перорально (в дозе 0,5 мг/кг и 10 мг/кг соответственно) наблюдаются антиамнестические эффекты, которые усиливаются при субхроническом введении в течение 9 дней, тогда как при инъекциях цПГ усиления эффекта не наблюдается [32]. Эффекты ноопепта и цПГ не идентичны, и это может быть связано с тем, что-либо ноопепт в отличие от цПГ, обладает накопительным действием, либо действие последнего усиливается под влиянием других метаболитов.

Другой причиной различия эффектов после внутрибрюшинного и интраназального введения пептидов может быть первичное поступление в разные области мозга. Внутрибрюшинное введение сравнимо с внутривенным, при котором небольшие пептиды проникают в мозг через гематоэнцефалический барьер и с общим кровотоком достигают разных отделов мозга [33, 34]. Выявлено, что вещества, попадающие в мозг по обонятельному нерву, преимущественно распределяются в ростральные отделы мозга, включая обонятельные луковицы, фронтальную кору, гиппокамп, миндалину [33, 35, 36].

В наших экспериментах более выраженное ноотропное действие семакса и ноопепта при интраназальном введении свидетельствует о том, что пептиды посредством экстранейронального пути через обонятельный эпителий попадают в большей степени в области мозга, связанные с процессами памяти и обучения, а при внутрибрюшинном введении преимущественно в структуры мозга, ответственные за эмоциональный статус (передний мозг и лимбические области), вследствие чего преобладает анксиолитический эффект.

Схожее влияние на поведение мышей BALB/c ранее наблюдалось при сопоставлении внутрибрюшинного и интраназального введения селанка, также относящегося к классу регуляторных пептидов [37]. Эту разницу в соотношении ноотропного и анксиолитического компонентов пептидных препаратов в зависимости от пути введения можно использовать для достижения необходимого терапевтического эффекта.

Выводы

1. Пептиды семакс (0,6 мг/кг) и ноопепт (1 мг/кг) при внутрибрюшинном и интраназальном введениях усиливают исследовательскую активность и понижают тревожность мышей BALB/c в условиях теста «закрытый крестообразный лабиринт».

2. Ноотропный эффект семакса и ноопепта сильнее проявляется при их интраназальном введении по сравнению с внутрибрюшинным (семакс: 36% — при и/н против 16% — при в/б, ноопепт: 29% — при и/н против 2% — при в/б).

3. Анксиолитическая активность семакса и ноопепта в большей степени наблюдается при внутрибрюшинном введении в сравнении с интраназальным (семакс: 57% — при в/б против 40% — при и/н, ноопепт: 53% — при в/б против 34% — при и/н).

4. Полученные результаты позволяют предположить, что интраназальное введение ноопепта может изменить фармакологический профиль ноопепта в сторону увеличения ноотропного компонента.