Разработка ВЭЖХ-методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови
Аннотация
Ключевые слова
Для цитирования:
Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Гацанога М.В. Разработка ВЭЖХ-методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2017;(2):35-38.
For citation:
Yakusheva E.N., Chernykh I.V., Shulkin A.V., Gatsanoga M.V. Design of HPLC methods of fexofenadine quantitative analysis in blood plasma. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2017;(2):35-38. (In Russ.)
Введение
Гликопротеин-P (Pgp, ABCBl-белок) представляет собой АТФ-зависимый мембранный транспортёр, принадлежащий к суперсемейству ABC-транспортёров (Adenosine-Binding-Cassete), функционирующий как эффлюксный насос, удаляющий из клеток во внеклеточное пространство липофильные вещества эндогенной и экзогенной природы. Спектр его субстратов включает большое число лекарственных средств разных фармакологических групп [1]. В связи с вариабельной активностью, которая может изменяться под действием различных факторов, в том числе в результате приёма лекарственных средств, а также полиморфизмом кодирующего его гена MDR1 (MultiDrug Resistance), необходимо оценивать интенсивность функционирования ABCB1-белка для прогнозирования возможных межлекарственных взаимодействий.
Одним из методов оценки функциональной активности ABCB1-белка in vivo является изучение фармакокинетики его маркерных субстратов в динамике [2]. К числу маркерных субстратов ABCB1-белка относятся фексофенадин, дигоксин, домперидон и др. средства (ссылка на FDA).
Фексофенадин — гистаминолитик III поколения, широко применяющийся для симптоматической терапии аллергического ринита и крапивницы [3]. Препарат является активным метаболитом терфенадина — лекарственного средства предыдущего поколения, поэтому он практически не подвергается метаболизму в организме. В его энтеральной абсорбции, распределении и экскреции ведущая роль принадлежит ABCB1- белку [1, 4], в связи с чем фексофенадин считается его маркерным субстратом. Изменение фармакокинетики препарата отражает изменение функционирования транспортёра.
Преимуществами фексофенадина как маркерного субстрата являются:
•отсутствие биотрансформации;
•большая широта терапевтического действия;
•достаточно высокие концентрации в плазме крови при введении в терапевтической дозе;
•низкая частота неблагоприятных побочных реакций
•отсутствие кумуляции в организме;
•доступная стоимость оригинального препарата;
•безрецептурный отпуск из аптек.
Указанные свойства позволяют использовать фексофенадин в качестве маркерного субстрата как в эксперименте, так и в клинике, что делает целесообразным разработку ВЭЖХ-методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови людей.
Методы
Для количественного определения фексофенадина в плазме крови с помощью ВЭЖХ использовали хроматографическую систему Stayer (Аквилон, Россия) с УФ-спектрофотометрическим детектором UVV 104, петлевым краном-дозатором PEEK с петлей ввода на 100 мкл, аналитическим ручным инжектором для ввода пробы модели 7725i (Rheodyne, США) при длине волны 220 нм. Использовали обращеннофазную хроматографическую колонку: Phenomenex Synergi 4u Polar-RP 80A (250 x 4,6) с зернением 4 мкм и термостатированием при 35 °С. Ввод проб в петлю хроматографа производили с помощью шприца «Microsyringes» (Германия).
В качестве вспомогательного оборудования при подготовке проб применяли деионизатор «Водолей» (Аквилон, Россия), центрифугу «Elmi CM 6M» (Elmi, Латвия), встряхиватель пробирок «Shaker S 3.01» (Elmi, Латвия), встряхиватель лабораторный медицинский «Vortex» (Elmi, Латвия), роторно-вакуумный испаритель «VV — Micro» (Heidolph, Германия).
В качестве стандарта использовали субстанцию фексофенадина гидрохлорида, производства Sigma. Субстанция имела сертификат качества, подтверждающий количественное содержание фексофенадина гидрохлорида 99,2%. Рабочий раствор (100 мкг/мл) готовили на метаноле и хранили при температуре 40 °С.
Определение концентрации фексофенадина в плазме крови выполняли методом абсолютной калибровки по площади пиков. Калибровочные растворы готовили путём добавления к интактной плазме крови рассчитанного объёма раствора стандарта фексофенадина гидрохлорида с концентрацией 10 мкг/мл.
Калибровочную зависимость площади хромато-графического пика от концентрации фексофенадина определяли в диапазоне концентраций 100—1000 нг/мл по 6 точкам (указанный диапазон концентраций наблюдается при пероральном приёме 180 мг фексофена-дина [5], для каждой точки выполняли по 5 измерений.
Для экстракции фексофенадина из плазмы крови и приготовления подвижной фазы применяли следующие реактивы: ацетонитрил «для ВЭЖХ» (Merck, Германия), кислота уксусная ледяная ХЧ (Экос-1, Россия), триэтиламин «для ВЭЖХ» (Lab-Skan, Польша).
Для расчёта метрологических характеристик разработанной методики, а также её основных валидаци- онных параметров (точность, прецизионность) применяли программы «StatistRa 7.0» и «Microsoft Excel», а также руководство Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation (2013) [6]. Характер распределения данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Для оценки зависимости плазменной концентрации фексофенадина от площади хроматографического пика использовали коэффициент корреляции Пирсона.
Результаты
Анализ ряда существующих методик [7—14] показал, что большинство из них мало пригодны для анализа фармакокинетики фексофенадина у людей в большинстве отечественных лабораторий.
Исследование выполняли в изократическом режиме. В качестве подвижной фазы применяли смесь ацетонитрил—вода—кислота уксусная ледяная-триэтиламин в соотношении 267:128:4,7:7 с pH 6,15. Время удерживания фексофенадина составило 14,91±0,25 мин. Критическим параметром для времени удерживания оказалось значение pH. Предел определения и предел детектирования составили соответственно 69,24 и 31,61 нг/мл.
Экстракцию фексофенадина из плазмы крови осуществляли ацетонитрилом (2 мл плазмы и 4 мл ацетонитрила) путём встряхивания на приборе Shaker при 400 об/мин 15 мин, центрифугирования при 3 500 об/мин 15 мин и упаривания супернатанта при 50 °С. Коэффициент экстракции составил 84,14%.
Метрологические характеристики методики представлены в табл. 1.
В указанном диапазоне концентраций зависимость «концентрация фексофенадина — площадь пика» носила линейный характер (рис. 1). Коэффициент детерминации составил 0,9998. Уравнение регрессии имело вид: у = 3,3737 x x +11,724, где x — площадь хроматографического пика, а у — концентрация фексофенадина.
Образцы полученных хроматограмм представлены на рис. 2—3. Пики фексофенадина отделены от пиков эндогенных соединений, что позволяет достоверно определить исследуемое вещество.
Коэффициент разделения (разрешения) пика фексофенадина и ближайшего пика соэкстрактивных веществ (см. рис. 3) вычисляли как разность времен удерживания указанных пиков, разделённых на сумму их широт на половине высот. Данный параметр составил 1,3.
На рис. 4 представлен участок хроматограммы, демонстрирующий пределы обнаружения и количественного определения аналита, которые вычислялись как концентрации аналита, дающие, соответственно, пики с высотами, 3-кратно и 10-кратно превышающими высоту пиков шума на расстоянии, 20-кратно превышающем ширину пика на половине его высоты. Ширина пика пробы с концентрацией 1 000 нг/мл на половине его высоты составляла 0,25 мин, что соответствует 10-минутному участку хроматограммы [15].
Обсуждение
FDA требует все потенциально выходящие на рынок лекарственные средства подвергать анализу на их возможную принадлежность к субстратам и модуляторам функциональной активности АВСВ1-белка [16]. Причём, анализ in vivo рекомендовано осуществлять по фармакокинетике маркерных субстратов транспортера.
Ведущим методом исследования фармакокинетики лекарственных средств как на доклиническом, так и на клиническом этапах является ВЭЖХ. Причём, универсальным и экономически доступным для большинства лабораторий является УФ-детектирование.
В научной литературе представлен широкий спектр ВЭЖХ-методик анализа фексофенадина в плазме крови как животных, так и людей. Однако большинство из них предназначено для исследования растворов лекарственных форм фексофенадина [12, 13], т. е. не учитывает необходимость его отделения от балластных веществ матрицы (плазмы крови). Многие авторы рекомендуют применение дорогостоящего масс-спектрофотометрического детектора [10, 11, 14], что требует значительных материальных затрат. Также ряд методик апробированы для животных, но не для людей [8, 14]. Большинство зарубежных авторов также предлагают использование экономически малодоступной твёрдофазной экстракции [9] и градиентный режим элюирования [14], что усложняет анализ.
Предлагаемая методика лишена указанных выше недостатков и характеризуется чувствительностью, специфичностью, простотой выполнения, высокой разрешающей способностью, воспроизводимостью и линейностью в диапазоне рабочих концентраций. Её применение рекомендуется для оценки фармакокинетики фексофенадина - маркерного субстрата АВСВ1-белка при анализе функциональной активности данного белка-транспортёра в клинических исследованиях.
Список литературы
1. Якушева Е.Н., Щулькин А.В., Попова Н.М., Черных И.В., Титов Д.С. Структура, функции гликопротеина-P и его значение для рациональной фармакотерапии. Обзоры по клин фармакол и лекарств тер. 2014; 12 (2): 3-11.
2. Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Попова Н.М. Іликопротеин-P: структура, физиологическая роль и молекулярные механизмы модуляции функциональной активности. Усп физиол наук 2014; 45 (4): 90-99.
3. Inami A., Matsuda R., Grobosch T., Komamura H., Takeda K., Yamada Y. et al. A simulated car-driving study on the effects of acute administration of levocetirizine, fexofenadine, and diphenhydramine in healthy Japanese volunteers. Hum Psychopharmacol. 2016; 31 (3): 167-177.
4. Li F., Howard K.D., Myers M.J. Influence of P-glycoprotein on the disposition of fexofenadine and its enantiomers. J Pharm Pharmacol. 2017; 69 (3): 274-284.
5. Кукес В.Г., Сычев Д.А., Бруслик Т., Хилова Р., Гасанов Н.А. Изучение транспортеров лекарственных средств как новая возможность персонализации фармакотерапии. Врач, 2007; 5: 2-5.
6. Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM). London; 2013.
7. Раменская Г.В., Скуридина Е.А., Красных Л.М. Разработка методики количественного определения маркера активности P-гликопротеина фексофенадина в плазме крови. Хим-фарм журн. 2006; 40 (12): 47-50.
8. Гацанога М.В., Черньа И.В., Щулькин А.В., Якушева Е.Н., Попова Н.М. Можно ли оценивать принадлежность лекарственных веществ к субстратам гликопротеина-P на самках кроликов породы Шиншилла? «Наука молодых» (Eruditio Juvenium) 2016; 4(4): 5-10.
9. Kanthiah S., Kannappan V. D-Optimal mixture design optimization of an HPLC method for simultaneous determination of commonly used antihistaminic parent molecules and their active metabolites in human serum and urine. Biomed Chromatogr. 2017, doi: 10.1002/bmc.3932 [Epub ahead of print].
10. Bosilkovska M., Samer C.F., Déglon J., Rebsamen M., Staub C., Daye P. et al. Geneva cocktail for cytochrome p450 and P-glycoprotein activity assessment using dried blood spots. Clin Pharmacol Ther. 2014; 96 (3): 349-359.
11. Muppavarapu R., Guttikar S., Rajappan M., Kamarajan K., Mullangi R. Sensitive LC-MS/MS-ESI method for simultaneous determination of montelukast and fexofenadine in human plasma: application to a bioequivalence study/ Biomed Chromatogr. 2014; 28 (8):1048-1056.
12. Hadir M.M., Maha A.S., Ileana V.O. Development of validated stability-indicating chromatographic method for the determination of fexofenadine hydrochloride and its related impurities in pharmaceutical tablets. Chem Cent J, 2011; 5: 76.
13. Karakus S., Kucukguzel I., Kucukguzel S.G. Development and validation of a rapid RP-HPLC method for the determination of cetirizine or fexofenadine with pseudoephedrine in binary pharmaceutical dosage forms. J Pharm Biomed Anal. 2008;4 6 (2): 295-302.
14. Tanaka Y., Yoshikawa Y., Yasui H. Development of a highly sensitive methodology for quantitative determination of fexofenadine in a microdose study by multiple injection method using ultra-high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Biol Pharm Bull. 2012; 35 (5): 698-704.
15. Эпштейн Н.А. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе (обзор). Хим-фарм журн. 2004; 38 (4): 40-56.
16. U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluationand Research. Guidance for industry: drug interaction studiesdstudy design, data analysis, implications for dosing, and labeling recommendations. Available at: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulator yInformation/Guidances/ucm292362.pdf.
Об авторах
Е. Н. ЯкушеваРоссия
И. В. Черных
Россия
А. В. Щулькин
Россия
М. В. Гацанога
Россия
Для цитирования:
Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Гацанога М.В. Разработка ВЭЖХ-методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2017;(2):35-38.
For citation:
Yakusheva E.N., Chernykh I.V., Shulkin A.V., Gatsanoga M.V. Design of HPLC methods of fexofenadine quantitative analysis in blood plasma. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2017;(2):35-38. (In Russ.)