Разработка ВЭЖХ-методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови

Введение

Гликопротеин-P (Pgp, ABCBl-белок) представляет собой АТФ-зависимый мембранный транспортёр, принадлежащий к суперсемейству ABC-транспортёров (Adenosine-Binding-Cassete), функционирующий как эффлюксный насос, удаляющий из клеток во внеклеточное пространство липофильные вещества эндогенной и экзогенной природы. Спектр его субстратов включает большое число лекарственных средств разных фармакологических групп [1]. В связи с вариабельной активностью, которая может изменяться под действием различных факторов, в том числе в результате приёма лекарственных средств, а также полиморфизмом кодирующего его гена MDR1 (MultiDrug Resistance), необходимо оценивать интенсивность функционирования ABCB1-белка для прогнозирования возможных межлекарственных взаимодействий.

Одним из методов оценки функциональной активности ABCB1-белка in vivo является изучение фармакокинетики его маркерных субстратов в динамике [2]. К числу маркерных субстратов ABCB1-белка относятся фексофенадин, дигоксин, домперидон и др. средства (ссылка на FDA).

Фексофенадин — гистаминолитик III поколения, широко применяющийся для симптоматической терапии аллергического ринита и крапивницы [3]. Препарат является активным метаболитом терфенадина — лекарственного средства предыдущего поколения, поэтому он практически не подвергается метаболизму в организме. В его энтеральной абсорбции, распределении и экскреции ведущая роль принадлежит ABCB1- белку [1, 4], в связи с чем фексофенадин считается его маркерным субстратом. Изменение фармакокинетики препарата отражает изменение функционирования транспортёра.

Преимуществами фексофенадина как маркерного субстрата являются: 

•отсутствие биотрансформации;

•большая широта терапевтического действия;

•достаточно высокие концентрации в плазме крови при введении в терапевтической дозе;

•низкая частота неблагоприятных побочных реакций

•отсутствие кумуляции в организме;

•доступная стоимость оригинального препарата;

•безрецептурный отпуск из аптек.

Указанные свойства позволяют использовать фексофенадин в качестве маркерного субстрата как в эксперименте, так и в клинике, что делает целесообразным разработку ВЭЖХ-методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови людей.

Методы

Для количественного определения фексофенадина в плазме крови с помощью ВЭЖХ использовали хроматографическую систему Stayer (Аквилон, Россия) с УФ-спектрофотометрическим детектором UVV 104, петлевым краном-дозатором PEEK с петлей ввода на 100 мкл, аналитическим ручным инжектором для ввода пробы модели 7725i (Rheodyne, США) при длине волны 220 нм. Использовали обращеннофазную хроматографическую колонку: Phenomenex Synergi 4u Polar-RP 80A (250 x 4,6) с зернением 4 мкм и термостатированием при 35 °С. Ввод проб в петлю хроматографа производили с помощью шприца «Microsyringes» (Германия).

В качестве вспомогательного оборудования при подготовке проб применяли деионизатор «Водолей» (Аквилон, Россия), центрифугу «Elmi CM 6M» (Elmi, Латвия), встряхиватель пробирок «Shaker S 3.01» (Elmi, Латвия), встряхиватель лабораторный медицинский «Vortex» (Elmi, Латвия), роторно-вакуумный испаритель «VV — Micro» (Heidolph, Германия).

В качестве стандарта использовали субстанцию фексофенадина гидрохлорида, производства Sigma. Субстанция имела сертификат качества, подтверждающий количественное содержание фексофенадина гидрохлорида 99,2%. Рабочий раствор (100 мкг/мл) готовили на метаноле и хранили при температуре 40 °С.

Определение концентрации фексофенадина в плазме крови выполняли методом абсолютной калибровки по площади пиков. Калибровочные растворы готовили путём добавления к интактной плазме крови рассчитанного объёма раствора стандарта фексофенадина гидрохлорида с концентрацией 10 мкг/мл.

Калибровочную зависимость площади хромато-графического пика от концентрации фексофенадина определяли в диапазоне концентраций 100—1000 нг/мл по 6 точкам (указанный диапазон концентраций наблюдается при пероральном приёме 180 мг фексофена-дина [5], для каждой точки выполняли по 5 измерений.

Для экстракции фексофенадина из плазмы крови и приготовления подвижной фазы применяли следующие реактивы: ацетонитрил «для ВЭЖХ» (Merck, Германия), кислота уксусная ледяная ХЧ (Экос-1, Россия), триэтиламин «для ВЭЖХ» (Lab-Skan, Польша).

Для расчёта метрологических характеристик разработанной методики, а также её основных валидаци- онных параметров (точность, прецизионность) применяли программы «StatistRa 7.0» и «Microsoft Excel», а также руководство Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation (2013) [6]. Характер распределения данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Для оценки зависимости плазменной концентрации фексофенадина от площади хроматографического пика использовали коэффициент корреляции Пирсона.

Результаты

Анализ ряда существующих методик [7—14] показал, что большинство из них мало пригодны для анализа фармакокинетики фексофенадина у людей в большинстве отечественных лабораторий.

Исследование выполняли в изократическом режиме. В качестве подвижной фазы применяли смесь ацетонитрил—вода—кислота уксусная ледяная-триэтиламин в соотношении 267:128:4,7:7 с pH 6,15. Время удерживания фексофенадина составило 14,91±0,25 мин. Критическим параметром для времени удерживания оказалось значение pH. Предел определения и предел детектирования составили соответственно 69,24 и 31,61 нг/мл.

Экстракцию фексофенадина из плазмы крови осуществляли ацетонитрилом (2 мл плазмы и 4 мл ацетонитрила) путём встряхивания на приборе Shaker при 400 об/мин 15 мин, центрифугирования при 3 500 об/мин 15 мин и упаривания супернатанта при 50 °С. Коэффициент экстракции составил 84,14%.

Метрологические характеристики методики представлены в табл. 1.

В указанном диапазоне концентраций зависимость «концентрация фексофенадина — площадь пика» носила линейный характер (рис. 1). Коэффициент детерминации составил 0,9998. Уравнение регрессии имело вид: у = 3,3737 x x +11,724, где x — площадь хроматографического пика, а у — концентрация фексофенадина.

Образцы полученных хроматограмм представлены на рис. 2—3. Пики фексофенадина отделены от пиков эндогенных соединений, что позволяет достоверно определить исследуемое вещество.

Коэффициент разделения (разрешения) пика фексофенадина и ближайшего пика соэкстрактивных веществ (см. рис. 3) вычисляли как разность времен удерживания указанных пиков, разделённых на сумму их широт на половине высот. Данный параметр составил 1,3.

На рис. 4 представлен участок хроматограммы, демонстрирующий пределы обнаружения и количественного определения аналита, которые вычислялись как концентрации аналита, дающие, соответственно, пики с высотами, 3-кратно и 10-кратно превышающими высоту пиков шума на расстоянии, 20-кратно превышающем ширину пика на половине его высоты. Ширина пика пробы с концентрацией 1 000 нг/мл на половине его высоты составляла 0,25 мин, что соответствует 10-минутному участку хроматограммы [15].

Обсуждение

FDA требует все потенциально выходящие на рынок лекарственные средства подвергать анализу на их возможную принадлежность к субстратам и модуляторам функциональной активности АВСВ1-белка [16]. Причём, анализ in vivo рекомендовано осуществлять по фармакокинетике маркерных субстратов транспортера.

Ведущим методом исследования фармакокинетики лекарственных средств как на доклиническом, так и на клиническом этапах является ВЭЖХ. Причём, универсальным и экономически доступным для большинства лабораторий является УФ-детектирование.

В научной литературе представлен широкий спектр ВЭЖХ-методик анализа фексофенадина в плазме крови как животных, так и людей. Однако большинство из них предназначено для исследования растворов лекарственных форм фексофенадина [12, 13], т. е. не учитывает необходимость его отделения от балластных веществ матрицы (плазмы крови). Многие авторы рекомендуют применение дорогостоящего масс-спектрофотометрического детектора [10, 11, 14], что требует значительных материальных затрат. Также ряд методик апробированы для животных, но не для людей [8, 14]. Большинство зарубежных авторов также предлагают использование экономически малодоступной твёрдофазной экстракции [9] и градиентный режим элюирования [14], что усложняет анализ.

Предлагаемая методика лишена указанных выше недостатков и характеризуется чувствительностью, специфичностью, простотой выполнения, высокой разрешающей способностью, воспроизводимостью и линейностью в диапазоне рабочих концентраций. Её применение рекомендуется для оценки фармакокинетики фексофенадина - маркерного субстрата АВСВ1-белка при анализе функциональной активности данного белка-транспортёра в клинических исследованиях.