Сравнительный анализ активации пострецепторных сигнальных путей димерными дипептидными миметиками разных петель NGF

Введение 

Фактор роста нервов (NGF), один из представителей семейства нейротрофинов, со времени открытия в начале 50-х годов XX века привлекает внимание как возможное средство лечения нейродегенеративных заболеваний [1]. Однако применение NGF в клинике осложнено его малой устойчивостью в биологических жидкостях и низкой способностью проникновения через гематоэнцефалический барьер, а также серьёзными побочными эффектами, такими как существенная потеря массы тела и гиперальгезия [2]. В связи с этим актуальным является поиск низкомолекулярных соединений, обладающих необходимыми для фармакотерапии эффектами NGF, но свободных от недостатков полноразмерного белка.

NGF представляет собой гомодимер, каждый протомер которого состоит из 118 аминокислотных остатков, организованных в 7 бета-тяжей, связанных между собой 4 неупорядоченными регионами, называемыми петлями. При взаимодействии NGF со специфическим TrkA рецептором происходит его димеризация, автофосфорилирование и активация ряда сигнальных путей, включая фосфатидилинозитол-3 киназный (PI3K/Akt) и митоген-активируемый протеинкиназный (MAP/Erk) пути. При этом первый путь связывают в основном с нейропротекцией [3], а второй — с дифференцировкой клеток и гиперальгезией [4].

В НИИ фармакологии имени В. В. Закусова сформулирована гипотеза, что разные функции нейротрофина контролируются взаимодействием разных петель с одним и тем же Trk-рецептором [5]. В рамках этой гипотезы были сконструированы димерные дипептидные миметики 4-й петли NGF — ГК-2 (гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина)), 1-й петли — ГК-6 (гексаметилендиамид бис-(N-аминокапроил-глицил-L-лизина)) и 3-й петли ГТС-115 (гексаметилендиамид бис-(N-гамма-оксибутирил-L-лизил-L-гистидина)), для которых в экспериментах in vitro было показано наличие нейропротекторного эффекта [6, 7].

Целью настоящего исследования было сравнительное изучение влияния этих дипептидных миметиков NGF на активацию TrkA-рецептора и пострецепторных внутриклеточных сигнальных путей в культуре гиппокампальных клеток линии НТ-22.

Материалы и методы

1. Культура гиппокампальных клеток линии НТ-22

Иммортализованные клетки гиппокампа мыши линии НТ-22 рассеивали на чашки Петри диаметром 4          см, обработанные поли-D-лизином (BD Biosciences, San Jose, USA; 5 мкг/см2) с плотностью 20 тыс/см2 в среде DMEM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки (Gibco Life Technologies, New York, USA) и 2 мМ L-глутамина (ICN, Eschwege, Germany), и инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% СО2 до образования монослоя.

2. Внесение исследуемых соединений

ГК-2 (10-8М), ГК-6 (10-6М) и ГТС-115 (10-6М) вносили в культуральную среду в виде стерильного раствора в эффективных концентрациях, установленных в экспериментах по нейропротектороному действию этих соединений на культуре гиппокампальных клеток линии НТ-22. В качестве положительного контроля использовали NGF (10-9М). Клетки лизировали через 15, 30, 60 и 180 мин после внесения пептидов. Временные точки были выбраны, исходя из данных литературы по фосфорилированию Akt и Erk-киназ под действием NGF [8].

З. Исследование активации Trk-A-рецептора, PI3K/AKTи MAP/Erk-киназых пострецепторных путей

Содержание p-TrkA, TrkA, p-Akt1/2/3, Akt1/2/3, p-ERK1/2, ERK1/2 определяли с использованием метода Вестерн-блот анализа. Клетки соединяли с лизирующим буфером (Bio-Rad, Hercules, USA; 50 mM Tris-HCl, 5mM EDTA, 1mM DTT, 1% Triton X-100) при pH = 7,5 и температуре 4 °С их лизировали в течение 5        мин на льду, затем соскребали, помещали в центрифужную пробирку объёмом 1,5 мл и центрифугировали 10 мин при 13 000 об/с и 4 °С. Концентрацию белка в образцах измеряли по методу Фолина-Лоури [9]. Белки разделяли электрофорезом в 10% полиакриламидном геле (ПААГ; Bio-Rad, Hercules, USA) в присутствии додецилсульфата натрия [10]. Перенос белков с ПААГ на мембрану PVDF (Bio-Rad, Hercules, USA) осуществляли электроэлюцией в течение 45 мин. Преинкубацию Вестерн-блотов проводили в буфере TBS-T c 1% Tween-20 и 5% (масса/объём) обезжиренным молоком (Bio-Rad, Hercules, USA) в течение ночи. Затем мембраны инкубировали в присутствии мышиных моноклональных антител против фосфорилированной и нефосфорилированной формы тирозинкиназы А -p-TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) в разведении 1:1000, против кроличьих поликлональных антител к фосфорилированной и нефосфорилированной формы Akt1/2/3-киназ — p-Akt1/2/3(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), против фосфорилированной (кроличьи поликлональные антитела) и нефосфорилированной (мышиные моноклональные антитела) формы Erk1/2 — p-Erk1/2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) в разведении 1:1000 в течение 1 ч. Затем после отмывки в буфере TBS-T c 1% Tween-20 и 0,5% (массас/объём) обезжиренным молоком мембраны инкубировали в присутствии вторых козьих антител (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), конъюгированных с пероксидазой хрена (разведение 1:2000), в течение 1 ч. Детектирование белков осуществляли после отмывки от вторых антител в буфере TBS-T c 1% Tween-20 и 0,5% (масса/объём) обезжиренным молоком в реакции с ECL-реагентами (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), используя гель-документирующую систему Alliance UVITEC (UK). Денситометрию полученных изображений проводили с помощью программы GIMP2.

4. Статистический анализ

Для оценки межгрупповых различий при сравнении двух групп использовали U-критерий Манна- Уитни. Данные указаны в m ± s. d.

Результаты и их обсуждение

Хорошо известно, что основные биологические функции NGF — нейропротекция и дифференцирующая активность — реализуются при его взаимодействии с TrkA рецепторами и опосредованы, главным образом, PI3/Akt и MAP/Erk пострецепторными сигнальными каскадами. Изучение возможного влияния миметиков 1-й, 3-й и 4-й петель NGF ГК-6, ГК-2 и ГТС-115 на фосфорилирование TrkA, Akt и Erk-киназ проводили на гиппокампальных клетках линии HT-22 c помощью Вестерн-блот анализа с использованием антител к фосфорилированным и нефосфорилированным формам этих киназ.

Было показано, что все миметики взаимодействуют с TrkA-рецептором, но при этом имеют разную картину пострецепторного сигналинга: ГК-6 и ГТС-115, подобно NGF, активируют MAP/Erk- и PI3/Akt, в то время как ГК-2 — только PI3/Akt-сигнальный путь. Как видно из рис. 1—3, достоверное увеличение фосфорилирования TrkA рецептора и Akt-киназ наблюдалось через 15, 30, 60 и 180 мин после внесения ГК-2, через 15, 30, 60 мин после внесения ГК-6, через 30, 60, 180 мин после внесения ГТС-115, а Erk-киназ под действием NGF, ГК-6 и ГТС-115 через 30 и 60 мин.

Известно, что основным сигнальным путём TrkA-рецептора обеспечивающим выживаемость нейронов является фосфатидилинозитол-3 / Akt киназный путь. Одной из мишеней, активированного NGF фосфатидилинозитол-3-киназного пути является серин/ треониновая киназа Akt или протеинкиназа Б. С использованием ингибирования Akt-киназы было показано, что 80% NGF-индуцированной выживаемости симпатических нейронов обусловлено активацией этой киназы [11—13]. В нейронах Akt-киназа регулирует нейритов, ни на дифференцировку [3].

Второй сигнальный путь, участвующим в выживании нейронов является MAP-Erk-киназный. Известно, что активация этого сигнального пути в основном вовлечена в такие эффекты NGF, как дифференцировка, синаптическая пластичность, долговременная потенциация и в один из побочных эффектов применения NGF — гиперальгезию [14].

Ранее на культуре гиппокампальных клеток линии НТ-22 нами было показано наличие у пептидных миметиков разных петель NGF нейропротекторного эффекта [5, 7]. При этом миметики 1-й (ГК-6) и 3-й (ГТС-115) петель обладали и дифференцирующим действием на культуре феохромоцитомы крысы линии РС12, а миметик 4-й петли ГК-2 — нет. Такие разные эффекты соединений могли быть связаны с разной активацией пострецепторных путей специфического нейротрофинового TrkA-рецептора. Полученные результаты подтверждают имеющиеся данные литературы, свидетельствующие о возможности дивергенции эффектов NGF. В работе S. Mahapatraetal. [15] было показано, что точечные мутации в структуре NGF приводят к изменению соотношения активации Akt и MAP-киназного путей. Так, мутантная форма NGF 7—84—103 (SS-1) при внесении в культуру клеток РС12 характеризовалась снижением активации MAP-киназного пути и усилением активации PI3/ Akt-киназного (соотношение Akt/MAP 0,75/0,25). Этими авторами было выдвинуто предположение о том, что строение сигнального трансдукционного комплекса, состоящего, по меньшей мере, из 6 адапторных белков, связанных с Tyr490 зависит как от взаимодействий внутри самого внутриклеточного домена, так и от связывания NGF с экстраклеточным доменом. Причём тип строения этого комплекса может приводить к разделению внутриклеточных сигнальных путей. В работах H. U. Saragovietal. [16] в экспериментах invitro было показано, что комплекс NGF с антителами против С-конца этого белка активирует TrkA рецептор и обладает нейропротекторными свойствами, но в отличие от фактора роста нервов не вызывает дифференцировку. S. Capsonietal. [17] приводит данные о том, что у пациентов с наследственной сенсорной автономной нейропатией V типа, имеющих мутацию в гене NGFB (экзон 3) с заменой аргинина в положении R100 на триптофан, полностью отсутствует болевая чувствительность без нарушения большинства неврологических функций.

Выводы

Полученные данные позволяют заключить, что вновь синтезированные низкомолекулярные миметки разных петель NGF проявляют свои эффекты через тирозинкиназные рецепторы и относительно избирательны в отношении активации внутриклеточных сигнальных путей, ответственных за биологические эффекты этого нейротрофина. Исследование биохимических свойств дипептидных миметиков 1-й, 4-й и 3-й петель NGF показывает, что картины активации пострецепторных путей сходны у пространственно сближенных 3-й и 1-й петли нейротрофина.