Сравнение поведенческих и нейрорецепторных эффектов пантогама и бемитила при одно- и многократном введении мышам C57BL/6 и BALB/c

Введение

Фармакологические эффекты психотропных средств имеют различные динамические характеристики при их применении в клинической практике. К медленно развивающимся эффектам препаратов относятся ноотропный, антидепрессивный и антипсихотический. Быстро проявляющимися эффектами являются психостимулирующий, анксиолитический и седативный [1, 2]. В 19601970 гг. критерии принадлежности к группе ноотропов ограничивались способностью к активации процессов обучения, к улучшению памяти и умственной деятельности, а также к повышению устойчивости мозга к агрессивным воздействиям [3]. Позже рамки канонических психофармакологических свойств пирацетама были расширены за счёт так называемых «неспецифических» компонентов, в частности, анксиолитического и стимулирующего, что нашло подтверждение и в экспериментальной фармакологии [4]. Более того, с привлечением инбредных мышей C57BL/6 и BALB/c было обнаружено, что характер и темпы развития «специфического» (ноотропного) и «неспецифического» (анксиолитического) составляющих психофармакологических эффектов пирацетама зависят и от базового поведенческого и нейрорецепторного статуса животных [5]. Также установлено, что указанные закономерности характерны для реализации действия и других препаратов с ноотропными свойствами — фенотропила, нооглютила, семакса, ацефена [6], ноопепта [7].

Поэтому с целью углубления понимания характера и механизмов, описанных выше, закономерностей в настоящей работе была предпринята попытка изучить в сравнительном плане психофармакологические и нейрорецепторные эффекты отечественных препаратов — пантогама (ноотропа, обладающего мягким седативным компонентом действия [8]) и бемитила, профиль фармакологического действия которого включает психостимулирующую [9] и ноотропную [10] активность.

Методология

Экспериментальное исследование особенностей реализации действия и нейрорецепторных эффектов пантогама и бемитила проведены на мышах инбредных линий BALB/c и C57BL/6.

1. Исследование эффективности исследовательского поведения по методике крестообразного лабиринта.

Исследовательское поведение и тревожность оценивали в крестообразном лабиринте [11]. Исследования проводили на самцах мышей линий BALB/c (n=45) и C57BL/6 (n=43), полученных из питомника «Столбовая», массой 2325 г, которых содержали в виварии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» в стандартных условиях при свободном доступе к воде и корму.

Препараты вводили внутрибрюшинно, один раз в сутки, в дозах 200 мг/кг (пантогам) и 25 мг/кг (беми тил). Каждую линию мышей разделяли на контрольную (физиологический раствор) и опытную группу. После 1кратного, субхронического (в течение 7 суток) и хронического (14 суток) введения препарата мышей тестировали в крестообразном лабиринте. Подробное описание метода и интерпретации показателей представлены в предыдущих публикациях [12].

Для представления эффективности исследовательского поведения (ЭИП) был введён нормированный параметр, который является совокупностью двух главных параметров ЭИП в крестообразном лабиринте — показателей числа визитов в боковые отсеки во время первого патрулирования и общего числа патрулирований. Нормированный параметр является среднеарифметической суммой данных показателей, при этом вклад каждого из них равноценен. Формула расчёта нормированного параметра = ((100(F_PtrN4)*11,111) +PatrlN*33,33)/2 (где F_PtrN — длина первого цикла патрулирования и PatrlN — число циклов патрулирования). Тревожность оценивали по латентному периоду первого захода в боковой отсек лабиринта.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Statistica 6.0.

После исследования в лабиринте в 1й, 7й и 14й день введения препаратов мышей декапитировали, извлекали структуры головного мозга и замораживали в жидком азоте для последующего проведения радиолигандного анализа с бензодиазепиновыми и NMDA-рецепторами. Результаты экспериментов ex vivo оценивали с помощью рассчитанных величин Kd, отражающей степень сродства рецептора к лиганду (нМ), и Bmax, представляющей количество мест связывания лиганда (фемтомоль/мг белка), соответственно.

2. Связывание с NMDA рецепторами.

а) Выделение плазматических мембран гиппокампа проводили по методу [13]. Гиппокампы размельчали в гомогенизаторе «тефлонстекло» в 10 объёмах буфера №1 (5mМ НЕРЕS, 4.5 mM Tris, 0.32 M Сахароза, рН 7.6). Гомогенат разбавляли 50 объёмами буфера №2 (5mМ НЕРЕS, 4.5 mM Tris, рН 7.6) и центрифугировали при 1000 g 10 минут на ультрацентрифуге Beckman L735. Супернатант сливали и повторно центрифугировали при 25000 g 20 мин. Для увеличения выхода белка супернатант центрифугировали дважды. Полученный осадок ресуспендировали в 50 объёмах буфера №2 и вновь центрифугировали при 8000 g 20 мин. Супернатант и верхний коричневый осадочный слой сливали и центрифугировали при 25000 g 20 мин. Осадок ресуспендировали в 50 объёмах буфера №3 (5mМ НЕРЕS, 4.5 mM Tris, 1 mM Na4EDTA, рН 7.6) и троекратно центрифугировали при 25000 g 20 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 50 объёмах буфера №2 и однократно центрифугировали при 25000 g 20 мин. Конечный осадок сохраняли в 5 объёмах буфера №2 и замораживали в криопробирках в жидком азоте.

В день анализа ткань размораживали, разбавляли 10 объёмов буфера №2, центрифугировали при 25000 g 20 мин. Осадок ресуспендировали в необходимом количестве буфера №2. Концентрация белка в образцах мембран составляла 23 мг/мл.                 

б) Радиолигандный анализ. В эксперименте использовали меченный тритием (+)МК801 с удельной активностью 200 Кюри/ммоль, полученный методом твердофазного катализа в Отделе химии физиологически активных веществ Института молекулярной генетики РАН (рук. — академик Н.Ф. Мясоедов) [14]. Реакционная смесь (конечный объём 0,5 мл) содержала 200 мкл буфера №2, 50 мкл меченного лиганда (в диапазоне концентраций от 0.1 до 20 нМ) и 250 мкл суспензии мембран. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 50 мкл немеченого (+)МК801 (1μМ). Специфическое связывание рассчитывали, как разницу между общим и неспецифическим связыванием.  Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman), предварительно смоченные 0,3% полиэтиленимином в течение 2 часов при 4°С.

Каждую пробирку промывали один раз холодным буфером №2, затем фильтры промывали три раза тем же объёмом буфера. Фильтры просушивали на воздухе, переносили в сцинтилляционные флаконы, заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости на основе толуола.

3. Связывание с бензодиазепиновыми рецепторами.

а) Выделение плазматических мембран коры. Ранее замороженные образцы коры мозга гомогенизировали в 16 мл ледяного (04°C) 50 mM TrisHCl буфера (рН 7,4) используя ручной гомогенизатор «тефлонстекло». Полученную суспензию центрифугировали при 42 000 g в течение 25 мин в ультрацентрифуге Allegra 64k R («Beckman Coulter»).

После центрифугирования супернатант    сливали, осадок ресуспендировали повторной гомогенизацией в том же объёме буфера, затем вновь центрифугировали. Процедуру отмывки проводили трижды, полученный осадок ресуспендировали в 20 мл TrisHCl буфера и использовали по 250 мкл в процедуре связывания [3H]Флунитразепама.                              

б) Радиолигандный   анализ. Мембранную фракцию структур головного мозга инкубировали с 3H-Флунитразепамом (удельная активность 81 Кюри/ммоль, “NEN”) в течение 30 мин при температуре 0-40C.  Неспецифическое связывание определяли в присутствии избытка немеченого диазепама (20 мкМ). Специфическое связывание рассчитывали, как разницу между общим и неспецифическим связыванием.  Процесс связывания останавливали путём добавления ледяного буфера и быстрой фильтрации через               стекловолокнистые                фильтры типа GF/B (Whatman) с последующей двукратной промывкой ледяным буфером общим объёмом 8 мл.       

Фильтры высушивали в течение 12 часов при ком              натной температуре, затем помещали в сцинтилляционную жидкость (реактив Брея) объёмом 5 мл и использовали для счёта радиоактивности.

Радиоактивность каждой пробы измеряли в течение 2 мин на жидкостносцинтилляционном счётчике TriCarb  2900TR  (“PerkinElmer”)  с  эффективностью    счёта 45%. Неспецифическое связывание составляло не более 10% от общего.             

Концентрацию белка измеряли по стандартной методике Лоури. Показатель количества мест связывания (В_max, фемтомоль/мг белка) и константу диссоциации        лигандрецепторных комплексов (Кd, наномоль/л, нМ) рассчитывали с помощью программы GraphPad Prism 5.      

Результаты

В предыдущих исследованиях, проведённых по аналогичному протоколу, было установлено, что между линиями мышей C57BL/6 и BALB/c наблюдаются значимые отличия по критерию ЭИП, по общему уровню тревожности, а также по плотности NMDA и бензодиазепиновых рецепторов в мозге. Так, мыши BALB/c проявляли в условиях незнакомой обстановки в закрытом крестообразном лабиринте бóльшую тревожность (+143%), менее выраженную эффективность исследовательского поведения (13%), меньшую плотность NMDAрецепторов в гиппокампе (22%) и БДЗрецепторов в префронтальной коре (17%) [15]. Результаты изучения влияния пантогама на ЭИП и тревожность мышей обеих линий после острого, субхронического и хронического введений представлены в табл. 1. Характерное для обеих линий животных поведение в группах плацебо сохраняется постоянным при всех режимах введения. Препарат оказал на линию BALB/c эффект увеличения ЭИП (64,2±6,1 баллов в контроле против 83,2±1,8 в опытной группе, р>0,05) лишь после 14кратного введения.

Напротив, под влиянием бемитила увеличение показателя ЭИП в группе мышей BALB/с происходило уже после однократного введения препарата в дозе 25 мг/кг, тогда как в группе сравнения С57BL/6 исследовательское поведение в опытной группе не отличалось от поведения контрольных групп животных. При этом тревожность под влиянием бемитила (латентное время первого захода) немного снижалась после 7кратного введения бемитила как у мышей BALB/с (на 2 с), так и у С57BL/6 (на 1,6 с).     

Сопутствующие изменения показателей радиолигандного связывания (т.н. «кривые насыщения») на NMDA и БДЗрецепторах приведены на рис. 1 и рис.2, соответственно.         

Результаты обработки по Скетчарду этих кривых насыщения для обоих рецепторов приведены в табл. 2 и 3.

Надо отметить, что величины Kd в мембранах структур мозга обеих линий мышей практически не различались при различных сроках введения препарата, что указывает на неизменяемость степени сродства мест связывания к лигандам при различных сроках воздействия препаратов.

Что касается плотности мест связывания Bmaх для [3H]MK801 с NMDA-рецепторами гиппокампа, то у мышей BALB/c эта величина увеличивалась для пантогама лишь к 14 дню эксперимента с 2036,8±88,0 фмоль/мг в контроле до 2593±73,1 фмоль/мг в опытной группе. В противоположность этому, бемитил был эффективен исключительно после острого воздействия, увеличивая величину B_maх с 2271±35,4 фмоль/мг в     контрольной группе до 3098±157,1 фмоль/мг в опытной группе. Примечательно, что в мозге мышей линии С57BL/6 изменений в плотности этих рецепторов не наблюдалось ни под влиянием пантогама, ни под воздействием бемитила (Табл.2, Рис.1).

Изучение изменений плотности БДЗрецепторов в            префронтальной коре мозга показало, что у мышей линии BALB/c острое и субхроническое введения пантогама и бемитила не влияли на величину Bmaх, тогда как при хроническом введении препаратов относительно группы плацебо (3117±53,5 фмоль/мг) наблюдалось снижение Bmaх до 2340±46,4 фмоль/мг и 2108±58,8 фмоль/мг, соответственно (табл. 3, рис. 2).

В группе мышей С57BL/6 плотность мест связывания [3H]флунитразепама после острого введения не изменилась по сравнению с контролем под действием обоих исследуемых препаратов. При субхроническом и хроническом введениях бемитил приводил к уменьшению Bmaх с 3602,5±27,2 фмоль/мг до 3047,5±111,0 фмоль/мг и с 3613±102,7 до 2616±86,7 фмоль/мг, соответственно. Под влиянием пантогама у мышей С57BL/6 наблюдалась разнонаправленная динамика: увеличение плотности мест связывания БДЗрецепторов с 3602,5±27,2 фмоль/мг до 4039±58,6 фмоль/мг при субхроническом введении и уменьшение мест связывания с 3613±102,7 фмоль/мг до 3241±106,4 фмоль/мг при хроническом введении (табл. 3, рис. 2).

Обсуждение

В соответствии с концепцией о составляющих фармакологических эффектах психотропных препаратов [16] у пирацетама обнаруживаются медленно развивающийся ноотропный («специфический») и быстро проявляющиеся «неспецифические» анксиолитический и психостимулирующий [4, 5, 17]. С помощью методов нейровизуализации рецепторов in vivo, в частности, позитронно-эмиссионной томографии, обнаружено снижение БДЗ-рецепторов в префронтальной коре мозга больных с проявлениями тревоги и паническими расстройствами [18]. Аналогичные данные получены при модельной патологии эмоциональной и когнитивной сфер в экспериментах на животных, в которых показана связь поведенческих компонентов с БДЗ- и NMDA-рецепторами мозга мышей [5, 6, 15].

В       продолжение изучения механизмов действия ноотропных препаратов была изучена динамика эффектов пантогама и бемитила. Пантогам (пантокальцин) — первый отечественный ноотроп, внедрённый в клиническую практику в 1977 году, мишенью первичного действия которого являются рецепторы γ-аминомасляной кислоты (ГАМК). Кроме ноотропной активности, препарат обладает мягким седативным эффектом [8]. Бемитил (метапрот) отечественный актопротектор, положительно влияющий на условно-рефлекторное поведение в норме и при стрессорном воздействии в тесте УРПИ [10], а также антиастеническим (психостимулирующим) компонентом в клинике [9]. Влияние этого препарата на нейрорецепторы мозга ранее не изучалось.

В настоящей работе мыши BALB/c были использованы в качестве модели с повышенной тревожностью и с дефицитом исследовательского поведения в тесте открытого крестообразного лабиринта, а также меньшей плотностью NMDA-рецепторов в гиппокампе и БДЗ-рецепторов в префронтальной коре мозга в сравнении с инбредными мышами C57BL/6 [15]. Кроме того, в недавно опубликованной работе было показано, что исследовательское поведение мышей этих линий в лабиринте и уровень проявленной при этом тревожности существуют статистически независимо друг от друга, на основании чего было предположено, что и механизмы их регуляции могут различаться [19].

Сравнительная динамика влияния пантогама на поведение и рецепторы представлена на рис. 3. Обращает внимание, что выраженность ЭИП и величина Bmax для NMDA-рецепторов нарастают постепенно, достигая уровней статистической значимости к 14му дню эксперимента. Аналогичная зависимость для ЭИП была характерна и для пирацетама [5], но плотность NMDA-рецепторов была выше уже после острого и 7кратного введения пирацетама. Возможно, быстрое изменение плотности этих рецепторов в случае пирацетама объясняет наличие у него стимулирующего компонента действия, тогда как более поздний подъём Bmax лежит в основе ноотропного эффекта. Дополнительным свидетельством в пользу данного предположения могут служить полученные данные о динамике эффектов бемитила (рис. 4): на мышах BALB/c препарат способствовал росту плотности NMDA-рецепторов и ЭИП лишь после однократного введения, тогда как длительное воздействие оказалось малоэффективным.

Таким образом, динамика эффективности исследовательского поведения в крестообразном лабиринте и количества NMDA-рецепторов в гиппокампе отражают специфические «медленные» эффекты пантогама как ноотропного препарата. Напротив, быстрый и не продолжительный подъём этих показателей после введения бемитила демонстрирует наличие скорее психостимулирующего, чем ноотропного компонента его психофармакологического профиля.

Выводы

1. Одно, семи и четырнадцатикратное введение пантогама в ежедневной дозе 200 мг/кг (в/б) мышам BALB/c вызывает медленное увеличение плотности NMDA-рецепторов в гиппокампе и постепенное нарастание специфического ноотропного эффекта. У мышей C57BL/6 количество NMDA-рецепторов и ЭИП не изменялись.
2. Бемитил в ежедневной дозе 25 мг/кг (в/б) при тех же режимах введения увеличивает ЭИП и плотность NMDA-рецепторов у мышей BALB/c лишь в результате однократного введения, что можно отнести к психостимулирующему компоненту его действия.
3. В данных условиях пантогам не воздействует на уровень тревожности мышей обеих линий, хотя плотность БДЗ-рецепторов снижалась к 14му введению.
4. Неспецифичное локальное снижение тревожности в обеих линиях мышей к 7му дню эксперимента не сопутствует поступательному уменьшению плотности БДЗ-рецепторов в коре мозга к 14му дню наблюдения.