Исследование биоэквивалентности препаратов ондансетрона с использованием метода ВЭЖХ-МС

Введение

Значительные успехи химиотерапии в последние годы основываются на развитии   поддерживающей и сопроводительной терапии, что позволило сделать лечение пациентов с онкологическими заболеваниями более эффективным. Практически весь спектр цитостатических препаратов имеет ряд выраженных побочных эффектов. Тошнота и рвота относятся к наиболее

частым осложнениям при проведении химиотерапии. Ещё совсем недавно около 10% больных отказывались от химиотерапии или прерывали её преждевременно из-за развития непереносимой тошноты и рвоты [1]. Ключевую роль в развитии острой тошноты и рвоты играет нейромедиатор — серотонин (5—НТ), высвобождение которого происходит при воздействии лучевой терапии или введении цитостатических препаратов из энтерохромаффинных клеток слизистой тонкой кишки.

Разработка и внедрение в широкую практику в начале 1990 г. антагонистов рецепторов 5—НТ3 позволили кардинально уменьшить тошноту и рвоту при проведении химиотерапии. За счёт селективного действия, эти препараты практически полностью купируют тошноту и рвоту, имея при этом минимальные побочные эффекты [2].

Антагонисты 5-HT3 рецепторов стали препаратами выбора среди противорвотных средств [3]. Внутри класса антагонистов 5-HT3 рецепторов существенных различий между препаратами в отношении их эффективности не выявлено [4].

Выбор препарата лечения основывается на индивидуальных особенностях пациентов. Ондансетрон — один из представителей группы антагонистов 5-HT3 рецепторов успешно применяется в клинической практике для купирования тошноты и рвоты развивающейся на фоне химиотерапии, лучевой терапии, а также тошноты и рвоты возникающей в послеоперационный период.

Цель исследования

Целью настоящего исследования является изучение биоэквивалентности препаратов Ондавелл, таблетки, покрытые плёночной оболочкой, 8 мг («ПТ. Новелл Фармасьютикал Лабораториз», Индонезия) и Эметрон®, таблетки, покрытые оболочкой 8 мг («Гедеон Рихтер А.О.», Венгрия).

Материалы и методы 

Оборудование

Высокоэффективный   жидкостной   хроматограф «Dionex ultimate 3000» (ФРГ), с масс-детектором Bruker micrOTOF-Q II (ФРГ).  Весы аналитические «MX5» «Mettler Toledo» (Швейцария).

Дозаторы переменного объёма на 50,0, 200,0 Колор «Ленпипет» (РФ) 1000,0; и 5000,0 мкл «Biohit» (Финляндия) со сменными одноразовыми пластиковыми наконечниками «Экохим» (РФ); аппарат для встряхивания жидкости «Genius 3», «Vortex» (США); центрифуга Centrifuge 5424, Eppendorf (ФРГ); пробирки Эппендорфа «Экохим» (РФ); калиброванные мерные колбы вместимостью 50; 100; 250; 1000 мл (ГОСТ 1770-74), мерные цилиндры объёмом 50, 250, 1000 мл (ГОСТ 1770-74).

Реактивы и растворы

Субстанция ондансетрона гидрохлорида 92,16% (Sun Pharma), субстанция трописетрона гидрохлорида, ацетонитрил 99,9% (LabScan), ацетат аммония 99% (Fluka), кислота муравьиная 50% (Fluka), аргон 99,95%, азот (Dominick Hunter) 99 %, вода Milli-Q.

Пробоподготовка

В пробирку Эппендорфа 1,5 мл отбирали 200 мкл плазмы, белки осаждали 400 мкл ацетонитрила, содержащего 10 нг/мл трописетрона (ТР) — внутренний стандарт. Раствор перемешивали 5 с на вихревой мешалке. Образец центрифугировали 3 мин при 14000 об/мин. 400 мкл супернатанта отбирали в 1,5 мл флаконы, прибавляли 400 мкл воды и помещали в термостат автосамплера при 10°С для последующего хроматографического анализа.

Методика количественного определения

Для количественного определения ондансетрона в плазме крови добровольцев при исследовании биоэквивалентности использован валидированный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ/ МС) [5].

Хроматографические условия:

• колонка XDB-С18 5 мкм 4,6×150 мм
• элюент — раствор 0,05% муравьиной кислоты и ацетонитрил в соотношении 25:75
• поток подвижной фазы — 0,6 мл/мин
• объём вводимой пробы — 50 мкл

Условия масс-детектирования:

Масс-детектор напряжение на игле - 5500 В, температура источника 220°C, расход осушающего газа 6 л/мин, давление распыляющего газа 1,5 бар.  Ионизация электрораспылением, регистрация положительных ионов, целевой ион ОНД 294,15±0,1 и ТР 285,15±0,1. Время удерживания ТР в этих условиях 4,21 мин, ОНД — 4,84 мин.

Скорость записи спектров 1 Гц. Общее время анализа 5,5 мин. Через каждые 50 анализов производилась промывка хроматографической   системы   в   течении 40 мин при потоке 1 мл/мин, градиент: [% ацетонитрила]                25→0→0→100→100→25→25, время [мин] 0→1→5→20→25→27→40.

Дизайн клинического этапа исследования

Расчёт фармакокинетических параметров

Для обсуждения биологической доступности лекарственных средств рассчитывали концентрации ондансетрона в плазме крови и определяли фармакокинетические параметры:

• максимальная концентрация (C_max) — максимальное значение из измеренных;
• время достижения максимальных концентраций (Т_max) — время, при котором измерялась Cmax;
• площадь под фармакокинетической кривой — в пределах длительности наблюдений (AUC_0-t) рассчитывают методом трапеций;
• площадь под кривой в интервале времени от 0 до ∞ (AUC_0-∞)
• среднее время удержания препарата в организме (MRT);
• значение С_max/AUC_0-t, отражающее скорость всасывания.

Фармакокинетические параметры рассчитывали на компьютере Pentium 4 с использованием программ «Bioeqv», статистическая обработка данных проведена с использованием «Excel», графика — «SigmaPlot». 

Результаты

Калибровочная кривая

Диапазон концентраций для калибровочной кривой выбрали в пределах от 1,0 до 50,0 нг/мл (рис. 1). Коэффициент корреляции R для кривой составил 0,9944. Калибровочная кривая описывалась уравнением y=0,070332×x0,014394, где х — концентрация ОНД, у — отношение площадей хроматографических пиков ОНД к ТР.

Валидация методики

Методика количественного определения ОНД была валидирована по нескольким параметрам, представленным в табл. 2, для доказательства её пригодности для исследований биоэквивалентности [6].

Основные фармакокинетические параметры и статистическая обработка данных

Усреднённые графики изменения концентрации ОНД в плазме крови добровольцев после приёма тестируемого и референтного препаратов представлены на рис. 6 (ср. значения ±90% дов.инт., n=18). Видно, что профили концентраций ондансетрона после применения таблеток Ондавелл «ПТ Новелл Фармасьютикал Лабораториз» (Индонезия) повторяют профили концентраций ондансетрона при использовании таблеток референспрепарата Эметрон® «Гедеон Рихтер А.О.» (Венгрия).

Рассчитанные основные фармакокинетические параметры представлены в табл. 3. Максимальные концентрации регистрируются спустя, в среднем, 2,14-2,33 ч после приёма препаратов и составляют для тестируемого препарата (x ±C.I. 90%) 25,42±3,82 нг/ мл, для препарата сравнения — 27,60±4,13 нг/мл. Параметр среднего времени удерживания (MRT) составил, соответственно, 4,62±0,17 и 4,83±0,21 ч. Нет достоверных различий и в параметре AUC, отражающем степень всасывания. Для тестируемых таблеток AUC0-12 (AUC0- ) — 138,93±19,97 (140,40±20,45), для препарата сравнения — 153,15±21,95 (160,19±22,37) нг/мл×ч. Отношения максимальных концентраций к площадям под фармакокинетическими кривыми Сmax/AUC0-12, отражающие скорость всасывания, для сравниваемых лекарственных препаратов, практически одинаковы и составили 0,183±0,010 (тест препарат) и 0,181±0,010 (препарат сравнения).

Для установления статистически значимых различий между препаратами проводили дисперсионный анализ значений Cmax, AUC0-t после их логарифмического преобразования (табл. 4).

Для установления статистически значимых различий между средними значениями показателя биоэквивалентности сравниваемых препаратов значение F для строки «препарат» (различия между препаратами) должно превзойти соответствующее табличное значение (таблица критерия Фишера для числа степеней свободы (1; n-2) и выбранного уровня значимости α).

Критическим значением для оценки вклада факторов типа препарата является значение F0,05;1;16 = 4,49. Как можно видеть, F-отношение для вклада фактора типа препарата нигде не превосходит этого критического значения.                         

Оценка биоэквивалентности изучаемых препаратов проводилась по показателям: AUC0-t, AUC0- , Сmax. В табл. 5 приведены границы 90% доверительного интервала для логарифмически преобразованных рассчитанных фармакокинетических параметров: AUC(_0-t) 95,07%-100,37%; для AUC (0-∞) 94,02%-99,74%, для Сmax 92,55%-100,95%.         

Выводы                                        

Значения всех определяемых параметров статистически достоверно не различались. Дисперсионный анализ значений lnAUC0-12, lnCmax, проведённый после их логарифмического преобразования, не выявил статистически значимых различий между препаратами. Границы оценённого 90% доверительного интервала для индивидуальных отношений логарифмически преобразованных значений (табл. 4) находятся в допустимых пределах: 80-125% для AUC0-12 и AUC0-∞ и 75-133% для Cmax [7].                   

Таким образом, препарат Ондавелл, таблетки, покрытые пленочной оболочкой,  8  мг  («ПТ.  Новелл Фармасьютикал Лабораториз», Индонезия) и препарат Эметрон®, таблетки, покрытые оболочкой, 8 мг («Гедеон Рихтер А.О.», Венгрия) биоэквивалентны.