Экспериментальное исследование фармакокинетики рифабутина в липосомальной форме

Введение

Рифабутин – противотуберкулезное антибактериальное средство широкого спектра действия, обладающее низкой растворимостью, что существенно ограничивает его применение. Терапия рифабутином часто оказывается малоэффективной в случае, если возбудители инфекционных заболеваний паразитируют внутри клеток хозяина. Способность липосом обеспечивать доставку лекарственных препаратов внутрь клетки делает их перспективными носителями для создания систем доставки рифабутина [1, 2]. Липосомы облегчают проникновение лекарственных препаратов внутрь клетки, что важно в случае лечения туберкулеза, так как возбудитель туберкулеза Мycobacterium tuberculosis является факультативным внутриклеточным паразитом, основная часть микобактерий находится в фагосоме макрофагов, что осложняет лечение заболевания. Кроме того, липосомы существенно увеличивают биодоступность лекарственных веществ при различных путях введения, не вызывают аллергических, пирогенных, иммунологических реакций [3]. Данные по изучению эффективности липосомальных антибиотиков показали возможность замены инъекционных форм пероральными. При этом возможно снижение дозы в два и более раз без потери терапевтической эффективности [4].

В ООО «Технология лекарств» разработана новая система доставки рифабутина в виде лиофилизированного липосомального порошка для эндотрахеального введения.

Целью настоящей работы явилось исследование фармакокинетики липосомальной формы рифабутина на животных после эндотрахеального введения, изучение распределения в тканях рифабутина, а также оценка относительной биодоступности новой лекарственной формы рифабутина в сравнении с субстанцией.

Экспериментальная часть

В исследовании использовали аутбредных белых крыс-самцов массой 220–250 г (Питомник лабораторных животных РАМН «Рапполово»), которые содержались в стандартных условиях вивария со световым режимом 12 часов света и 12 часов темноты на полнорационной сбалансированной по содержанию питательных веществ диете для лабораторных животных (по ГОСТ Р 50258-92). Эксперименты выполнены согласно методическим руководствам и нормативным документам, правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ Р 53434-2009), согласованном с «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей» и одобрены на заседании биоэтической комиссии СПб института фармации.

Исследуемый препарат – Рифабутин в липосомальной форме (ООО «Технология лекарств», Россия) вводили в трех дозах 6.5, 13 и 26 мг/кг однократно эндотрахеально с помощью аэрозоллера для мелких лабораторных животных (Penn-Century Inc., USA). Субстанцию рифабутина (Sichuan Med-Shine Pharmaceutical Co., Китай) вводили в дозе 13 мг/кг однократно эндотрахеально.

Пробы крови и органы (легкие, печень, сальник) отбирали после эвтаназии животных с помощью СО₂- камеры через 0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0, 10.0, 24.0, 48 ч. Количество животных на одну временную точку – 5. Образцы крови помещали в гепаринизированные пробирки, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин для получения плазмы. Образцы плазмы и органов были заморожены и хранились до анализа при температуре -20ºС.

Подготовка плазмы крови к анализу: в пробирку вместимостью 1,5 мл (типа «Эппендорф») помещали 0,2 мл плазмы, прибавляли 0,1 мл элюента, перемешивали, прибавляли 0,4 мл смеси дихлорметана и изооктана в соотношении 2:3 и экстрагировали аналит. Далее пробы центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут, органический слой отделяли. Экстракцию смесью дихлорметана и изооктана повторяли еще раз, органические слои объединяли, растворитель удаляли, сухой остаток растворяли в 0,2 мл метанола, пробу переносили в виалу для автосамплера и дозировали в ВЭЖХ-систему.

Подготовка органов к анализу: размороженный орган гомогенизировали в измельчителе тканей с элюентом в соотношении 1:2. 0,4 мл полученного гомогената переносили в пластиковую пробирку вместимостью 5 мл с завинчивающейся крышкой, прибавляли 2 мл смеси дихлорметана и изооктана, вортексировали 10 с и затем встряхивали 10 мин для экстракции аналита. Далее пробы центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут, органический слой отделяли. Процедуру экстракции повторяли еще раз. Объединенные извлечения помещали в пластиковые центрифужные пробирки вместимостью 5 мл, растворитель удаляли, сухой остаток растворяли в 0,2 мл метанола и переносили в виалу для автосамплера и дозировали в ВЭЖХ-систему.

Образцы анализировали на хроматографе высокого давления фирмы Shimadzu (Япония) с колонкой Luna C₁₈ (2) (4,6x150 мм, 5 µм) и предколонкой (3,0 мм) заполненной тем же сорбентом (Phenomenex, США) в изократическом режиме элюирования смесью буферного раствора с рН~4,0 (раствор, содержащий 3,8 г/л аммония уксуснокислого, доведенного ледяной уксусной кислотой до рН 4,0±0,2) и ацетонитрила в соотношении 50:50, скорость подачи элюента 1,0 мл/мин, объём пробы 20 мкл, длина волны детектирования 275 нм. Регистрация и обработка хроматограмм выполнена с помощью программного обеспечения LabSolution (Shimadzu, Япония).

Статистическая обработка данных выполнена с помощью программного обеспечения Microsoft Office Excel 2007. В таблицах приведены средние арифметические значения (), соответствующие им стандартные ошибки среднего значения (). Параметры фармакокинетики рассчитаны методом статистических моментов [5].

Результаты и обсуждение

Для анализа биологических проб плазмы разработали методику количественного определения рифабутина, которая была валидирована в соответствии с современными требованиями [6-9]. Методика была адаптирована для анализа проб органов и ревалидирована на примере проб печени. Основные валидационные параметры методик приведены в табл. 1.

Таблица 1

Валидационные параметры методик определения рифабутина в плазме крови и печени

Примечания: * y – площадь пика рифабутина; х – концентрация рифабутина, мкг/мл

Разработанные и валидированные методики определения содержания рифабутина были использованы для анализа проб плазмы крови и органов, полученных от лабораторных животных.

Для оценки фармакокинетики липосомальной формы рифабутина и ее линейности препарат был введен в трех дозах – 6.5, 13 и 26 мг/кг, параллельно для изучения относительной биодоступности была введена субстанция рифабутина в дозе 13 мг/кг. Полученные результаты приведены на рис. 1.

Рис. 1. Кривая «концентрация-время» рифабутина при однократном эндотрахеальном введении исследуемого препарата в различных дозировках и субстанции рифабутина (n=5, ±)

После введения субстанции и липосомальной формы рифабутина фармакокинетическая кривая имеет схожую форму (рис. 1). Максимальная концентрация в плазме крови достигается достаточно быстро – через 30 минут после введения. Далее наблюдается постепенное снижение концентрации рифабутина и к 48 часу эксперимента действующее вещество в плазме крови определяется в незначительных количествах. Концентрации рифабутина, определяемые в плазме крови статистически значимо выше после введения липосомальной формы.

Основные фармакокинетические параметры, рассчитанные методом статистических моментов, приведены в табл. 2

Таблица 2

Показатели фармакокинетики рифабутина при однократном эндотрахеальном введении препарата Рифабутин в липосомальной форме (ООО «Технология лекарств», Россия) и его субстанции ±

Основной параметр, характеризующий степень биологической доступности препарата Рифабутин в липосомальной форме, AUC_0-48, увеличивается с увеличением дозы линейно (рис. 2) и имеет статистически значимые различия в зависимости от вводимой дозы.

Рис. 2. Зависимость значений AUC_0-48 от величин вводимых доз препарата Рифабутин в липосомальной форме

Для проверки гипотезы линейности был проведен регрессионный анализ, в результате которого было установлено, что уравнение линейной регрессии является значимым (Р=0,0047), свободный член уравнения незначимо отличается от нуля: абсолютное значение критерия t составило 0,91 при критическом значении двустороннего t-критерия Стьюдента 4,30. Полученные результаты позволяют принять гипотезу линейности для изучаемых доз препарата Рифабутин в липосомальной форме.

Значения максимальной концентрации C_max также имеют статистически значимые отличия в зависимости от дозы. Среднее время удержания препарата (MRT) период полувыведения (T_1/2) и показатель C_max/AUC_t не имеют значимых отличий при изменении дозы препарата.

С целью оценки относительной биодоступности субстанции рифабутина и его липосомальной формы сравнивали значения максимальной концентрации (C_max), времени её достижения (T_max), площади под фармакокинетической кривой (AUC_0-48), полученные при введении изучаемых объектов в дозе 13 мг/кг.

Основной параметр, характеризующий степень биологической доступности препарата, AUC_0-48, а также максимальная концентрация C_max имеют статистически значимые отличия в зависимости от вводимого объекта: максимальная концентрация рифабутина после введения липосомальной формы в 3,7 раза выше, чем после введения субстанции, значения площади под фармакокинетической кривой выше в 5,2 раза.

Время достижения максимальной концентрации несколько выше после введения липосомальной формы, однако, статистически значимых различий установлено не было. Остальные параметры (MRT, T_1/2, C_max/AUC_t) также не имеют значимых отличий.

Относительная биологическая доступность рифабутина в липосомальной форме, рассчитанная как отношение площадей под фармакокинетической кривой «концентрация-время» для липосомальной формы и субстанции составила 522%. Полученные данные свидетельствуют о значимом увеличении биологической доступности рифабутина при эндотрахеальном введении его в липосомальной форме по сравнению с субстанцией.

Для липосомальной формы рифабутина было изучено накопление действующего вещества в ткани легких, а также распределение в тканях печени и сальника (рис. 3).

Рис. 3. Кривые «концентрация-время» рифабутина при однократном эндотрахеальном введении исследуемого препарата Рифабутин в липосомальной форме в различных органах (n=5, ±)

В исследуемых тканях рифабутин определяется уже через 15 минут после введения, максимум концентрации достигается через 30 минут. Минимальное количество действующего вещества (C_max около 1,4 мкг/г) наблюдается в сальнике – наименее васкуляризированной ткани. Для лёгочной ткани и ткани печени максимальная концентрация составила 21,8 и 12,8 мг/г, соответственно. Через 2 часа после введения липосомальной формы рифабутина в печени и лёгких наблюдается второй, менее выраженный, подъем концентрации рифабутина.

Интенсивность проникновения фармакологического средства в периферические ткани была охарактеризована тканевой доступностью (f_T), определяемой как отношение значения AUC в ткани (AUC_T) к соответствующей величине AUC в плазме, а также значением периода полувыведения и среднего времени удержания (T_1/2,T и MRT_T). Рассчитанные параметры приведены в табл. 3.

Таблица 3

Основные показатели проникновения рифабутина в сальник при однократном эндотрахеальном введении препарата Рифабутин в липосомальной форме (±)

Рифабутин в липосомальной форме интенсивно распределяется в ткани исследованных органов. Схожие результаты были получены при изучении распределения в тканях рифабутина на мышах после внутривенного введения липосомальной формы рифабутина [2]: в исследовании было установлено интенсивное распределение действующего вещества в ткани лёгких, селезёнки и печени. В проведённом исследовании концентрации рифабутина в сильно васкуляризированных органах значительно выше, чем в слабо васкуляризированных органах. В легочной ткани концентрации рифабутина значительно более высокие по сравнению с плазмой крови (площадь под фармакокинетической кривой в плазме в 36 раз меньше, чем в легких), среднее время удержания также наиболее высокое в легких.

Проведённое на крысах исследование фармакокинетики липосомальной лекарственной формы рифабутина показало, что после однократного введения препарата на трёх уровнях доз фармакокинетика препарата Рифабутин в липосомальной форме является линейной в диапазоне доз 6,5–26 мг/кг, действующее вещество интенсивно распределяется в сильно васкуляризированные органы, содержание его в слабо васкуляризированных органах значительно ниже.

Таким образом, включение рифабутина в липосомы является перспективной терапевтической системой для лечения или профилактики инфекционных заболеваний. Эндотрахеальное введение липосомального рифабутина крысам привело к повышению концентрации действующего вещества в месте введения (лёгких) по сравнению с введением чистого рифабутина, при этом относительная биодоступность рифабутина в липосомальной форме составила 522%.