Экспериментальное исследование биодоступности комбинированного препарата Диоксазид

Диоксазид – комбинированный препарат (лиофилизированная лекарственная форма), состоящий из 100 мг диоксидина и 250 мг изониазида, предназначен для лечения туберкулёза при внутрикавернозном введении.

Диоксидин – 1,4-Ди-N-окись 2,3-бис-(оксиметил) хиноксалина.

Подобно хиноксидину, является антибактериальным препаратом широкого спектра действия. Эффективен при инфекциях, вызванных синегнойной палочкой, палочкой дизентерии, сальмонеллами, стафилококками, стрептококками. Действует на штаммы бактерий, устойчивые к другим химиотерапевтическим препаратам, включая антибиотики [1].

Изониазид – гидразид изоникотиновой кислоты – является основным представителем производных изоникотиновой кислоты, нашедших применение в качестве противотуберкулёзных средств.

Обладает высокой бактериостатической активностью в отношении микобактерий туберкулёза. Препарат хорошо всасывается из ЖКТ. Максимальная концентрация в крови достигается через 1-4 часа после приёма внутрь; в течение 6-24 ч после приёма разовой дозы он находится в крови в бактериостатической концентрации [2]. Применяют изониазид для лечения всех форм и локализаций активного туберкулёза у взрослых и детей.

В Центре химии лекарственных средств «ВНИХФИ» совместно с ООО «Фермент» разработана лекарственная форма комбинации диоксидина и изониазида в виде лиофилизированного порошка, получившая название Диоксазид для лечения туберкулёза. Комбинация диоксидина и изониазида в опытах in vitro показала увеличение бактериостатической активности в отношении микобактерий туберкулёза, чем при отдельном применении изониазида [3].

В настоящей работе решалась задача исследования биодоступности диоксидина и изониазида применяемых отдельно и в комбинации в виде лекарственной формы Диоксазида (по 0,1 г субстанции диоксидина и 0,25 г изониазида) на животных после внутрибрюшинного введения.

Экспериментальная часть 

Животные. Исследование проводилось на беспородных крысах-самцах массой тела 160-180 г, полученных из питомника РАМН «Столбовая», Московская обл. Животных содержали в стационарных условиях при естественном световом режиме и стандартном рационе (комбикорм, вода). За 20 часов до начала эксперимента животных лишали пищи.

Препарат. Для отдельного применения использовали субстанции диоксидина и изониазида. При комбинированном применении использовали лекарственную форму (лиофилизированный порошок, содержащий в одном флаконе 100 мг диоксидина и 250 мг изониазида) изготовленную в ООО «Фермент» (Россия).

Способ введения и дозы. Сравниваемые препараты вводили однократно внутрибрюшинно в эквимолярных дозах в физиологическом растворе. Для диоксидина – 25 мг/кг, для изониазида – 62.5 мг/кг.

Отбор проб. Пробы крови после декапитации крыс в объёме 7-9 мл отбирали в стеклянные (10 мл) пробирки спустя 5, 15, 30, 60, 120, 240, 360 минут после введения препаратов. После центрифугирования при 3 тыс. об/мин отбирали 3 мл сыворотки, замораживали и хранили до анализа при температуре -200С.

Пробы печени (0,5 г) после декапитации крыс отбирали спустя 30, 60, 120 минут после введения, замораживали и хранили до анализа при температуре -200С.

ВЭЖХ-условия. Для определения диоксидина и изониазида в сыворотке крови крыс разработан метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяющий в одних хроматографических условиях фиксировать оба препарата.

Хроматографическая система «Waters». Колонка «Диасорб-130-C16Т», 7 мкм (250×4,6 мм). Элюент – 15% метанола: 85% вода, доведенная до рН=8,5 бутиламином и подкисленная фосфорной кислотой до рН=6,8. Скорость потока элюента – 0,8 мл/мин. Объем вводимой пробы (инжектор «Rheodyne») – 20 мкл. УФ-детектор при длине волны 260 нм. Время удерживания диоксидина – 7,6 мин, изониазида – 6,2 мин.

Извлечение. К 100 мкл плазмы крови прибавляли 200 мкл охлажденного метанола, перемешивали на приборе «Thermolyne Maxi Mix» (SYBRON). После центрифугирования при 14 тыс. об/мин 20 мкл надосадочной жидкости анализировали методом ВЭЖХ. Предел обнаружения диоксидина в сыворотке крови – 0,1 мкг/мл, изониазида – 0,5 мкг/мл.

Для извлечения изониазида из печени к водному гомогенату (1 мл) прибавляли 300 мкл изопропанола, экстрагировали препарат 3 мл хлороформа при активном встряхивании. После центрифугирования органический слой отделяли и упаривали досуха под током азота. Остаток растворяли при встряхивании в 200 мкл элюента, 50 мкл вводили в хроматографическую колонку. Извлечение изониазида из печени составило 80%; предел обнаружения – 0,5 мкг/0,5 г.

Концентрации препаратов в сыворотке крови крыс рассчитывали методом абсолютной калибровки с использованием интегрирующей хроматографической системы «МультиХром» «Амперсенд». Калибровочные кривые диоксидина и изониазида линейны в диапазоне 0,5-50 мкг/мл плазмы крови, 0.5-10 мкг/0.5 г печени. Полученные калибровочные графики (мкг/100 мкл плазмы, мкг/0,5 г печени) описываются линейным уравнением вида Y = aX + b, где:

для диоксидина a = 0,003; b = 0,15; r = 0,996

для изониазида a = 0,017; b = - 0,077; r = 0,992

для изониазида (печень) a = 0,224; b = - 0,257; r = 0,998

На рис. 1 представлены типичные хроматограммы контрольной сыворотки, сыворотки крови, содержащей диоксидин и изониазид и хроматограмма пробы сыворотки крови после введения комбинации препаратов.

Фармакокинетические параметры рассчитывали модельно-независимым методом (программа «M-IND»), статистическая обработка данных проведена с использованием «Origin 6.0», «SigmaPlot», графика – «SigmaPlot».

Результаты и обсуждение 

С целью оценки биологической доступности исследуемых лекарственных форм были определены концентрации диоксидина и изониазида в сыворотке крови крыс при отдельном и комбинированном применении препаратов, рассчитаны основные фармакокинетические параметры, позволяющие количественно охарактеризовать относительную степень всасывания действующего вещества (f '), величины площадей под фармакокинетическими кривыми зависимости «концентрация-время» (AUC0-360), время достижения максимальной концентрации (Тmax) и значения максимальных концентраций (Сmax). Оценку параметра (f ' ) – относительной степени всасывания – рассчитывали как отношение площадей AUC0-360 под фармакокинетическими кривыми при отдельном и комбинированном применении препаратов.

На рис. 2 и 3 представлены фармакокинетические профили содержания диоксидина и изониазида при индивидуальном введении и в комбинации.

В табл. 1 и 2 приведены рассчитанные по концентрационным кривым основные фармакокинетические параметры Сmax, Тmax, MRT (среднее время удержания), AUC (площадь под фармакокинетической кривой), CL (клиренс) и Vz (объём распределения) для диоксидина и изониазида.

Таблица 1. Фармакокинетические параметры диоксидина

Таблица 2. Фармакокинетические параметры изониазида

С целью оценки относительной биодоступности диоксидина и изониазида сравнивали значения максимальной концентрации (Сmax), времени её достижения (Тmax), площади под фармакокинетической кривой (AUC0-360), полученные при отдельном введении препаратов и в комбинации.

Диоксидин. Из приведённого рис. 2 видно, что профиль концентрации диоксидина при индивидуальном введении повторяет профиль концентрации при комбинации с изониазидом. Максимальные концентрации регистрируются спустя 15 мин после внутрибрюшинного введения в эквимолярных дозах 25 мг/кг и составляют при отдельном применении 44,6±6,9 мкг/мл, при комбинации – 36,3±5,2 мкг/мл. Незначительное увеличение степени всасывания (AUC), рассчитанное как отношение площадей под фармакокинетической кривой «концентрация-время» для комбинированного и индивидуального введения составило всего 5%:

F = AUC комбинация/AUC отдельно = 1.05

Таким образом, проведенные исследования показали, что изониазид не влияет на биодоступность диоксидина.

Изониазид. Из кинетической кривой, представленной на рисунке 3, видно, что при комбинированном применении наблюдаются достоверные различия в концентрациях препарата, начиная с 60 минут, по сравнению с индивидуальным введением. Абсорбция в кровь в обоих случаях чрезвычайно быстрая. Уже через 5 мин после внутрибрюшинного введения фиксируются максимальные концентрации изониазида, которые при отдельном применении составляют 93,0±18,6 мкг/мл, при комбинированном – 79,6±13,2 мкг/мл.

Относительная биодоступность изониазида, рассчитанная как отношение площадей под фармакокинетической кривой «концентрация-время» для комбинации и индивидуального введения составила:

F = AUC комбинация/AUC отдельно *100 = 65,3%.

Такое снижение биодоступности изониазида при комбинированном применении с диоксидином может быть объяснено нижеследующими положениями.

Диоксидин может выступать в роли индуктора метаболизма изониазида. Хорошо известно, что изониазид в живом организме активно подвергается процессу ацилирования N-ацетилтрансферазой [4]. Увеличение активности этого фермента приводит к снижению концентрации исходного изониазида.

Вместе с тем, наблюдаемое нами снижение концентрации в крови может происходить за счёт более быстрого и полного распределения изониазида по органам и тканям, т.е. диоксидин возможно способствует более быстрому и полному проникновению изониазида в периферические ткани, что и объясняет повышение бактериостатической активности в отношении микобактерий туберкулёза. Повышение значения Vz (объёма распределения) в случае комбинированного применения также является косвенным показателем улучшения проникновения в ткани. Аналогичную картину уже наблюдали на крысах при комбинации изониазида с антибиотиком рифампицином [5].

Проведённые нами исследования содержания изониазида в печени крыс показали, что количество изониазида в этом органе при применении препарата в комбинации с диоксидином возрастало, по сравнению с данными, полученными при индивидуальном применении (табл. 3).

Таблица 3. Концентрации изониазида в печени при отдельном введении субстанции
и в комбинации с диоксидином, в дозе 62,5 мг/кг (n=5)

Уже через 30 минут, концентрация изониазида в печени при комбинированном введении в 2,5 раза превышает таковую при индивидуальном применении.

Таким образом, после комбинированного введения диоксидина и изониазида наблюдается снижение концентрации изониазида в сыворотке крови и достоверное увеличение содержания в органах (в частности, в печени) по сравнению с индивидуальным применением.

Выводы

Проведённое на крысах исследование биодоступности лекарственной формы диоксазида (лиофилизированный порошок, содержащий в одном флаконе 100 мг диоксидина и 250 мг изониазида) показало:

1. при комбинированном применении изониазид не влияет на биодоступность диоксидина. Концентрации диоксидина в изученном временном интервале практически одинаковы;
2. При комбинированном применении происходит снижение концентрации изониазида в крови и увеличение содержания в печени, в сравнении с индивидуальным внутрибрюшинным введением препарата в эквимолярных дозах.