Сравнительное изучение антиишемической активности триметазидина и соединения АЛМ-802 в условиях эндотелиальной дисфункции

Введение

При изучении веществ, защищающих миокард от ишемического повреждения, эксперименты, как правило, проводят на интактных животных, у которых тем или иным способом моделируют ишемию миокарда [1]. Такой подход, хотя и даёт возможность принципиально оценить антиишемические свойства соединений, однако крайне далёк от реальной клинической ситуации. Из клинической практики хорошо известно, что у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) заболевание протекает на фоне сопутствующей патологии сосудистого русла, в частности эндотелиальной дисфункции (ЭД). Данные литературы подтверждают существование связи между ЭД и ИБС [2, 3]. Показано, что у пациентов с ИБС при нагрузке наблюдается расслабление ангиографически неповреждённых участков коронарных артерий, в то время как повреждённые участки артерий сокращаются. Вазоконстрикция во время нагрузки, по-видимому, связана с отсутствием в поражённых атеросклерозом участках сосудов эндогенных вазодилататоров, поскольку при перфузии тех же артерий органическими нитратами, которые являются эндотелий-независимыми вазодилататорами, все сегменты артерий отвечают расслаблением [4]. Необходимо также отметить, что у больных с распространённым атеросклерозом наблюдается сниженная эндотелий-зависимая реакция на ацетилхолин, при этом эндотелий-независимые реакции остаются неизменёнными [5]. Нарушение расслабления гладких мышц сосудов может увеличивать интенсивность приступов стенокардии у такого рода больных [6].

Известно, что формирование большинства адаптационных ишемических синдромов (stunnedmyocardium, гибернация и прекондиционирование) связано с особенностями метаболизма ишемизированных кардиомиоцитов [7, 8]. Показано, что в условиях ишемии миокарда основным источником АТФ является анаэробный гликолиз. При этом происходит подавление аэробного синтеза АТФ, осуществляемого за счёт физиологического αβ-окисления свободных жирных кислот, в результате чего в зоне неадекватного кровообращения миокарда резко возрастает содержание недоокисленных продуктов их метаболизма [9, 10]. Этот процесс получил название «метаболическое ремоделирование миокарда» [11]. Аномальное окисление свободных жирных кислот в ишемизированных кардиомиоцитах обуславливает формирование ишемической/постишемической дисфункции левого желудочка сердца, его ремоделирование и повышает риск развития злокачественных нарушений сердечного ритма [12, 13], а также инициирует процессы, ответственные за апоптоз кардиомиоцитов [14]. Накопленные данные о механизмах, лежащих в основе метаболического ремоделирования миокарда, позволили не только сформулировать теоретические подходы к медикаментозной цитопротекции – процессу восстановления энергетического метаболизма ишемизированных кардиомиоцитов путём подавления аномального метаболизма свободных жирных кислот, но и создали фундаментальную базу для внедрения в клинику лекарственных средств (мельдоний, триметазидин, ранолазин), объединённых под названием «парциальные ингибиторы окисления жирных кислот» – p-FOX ингибиторы (partialfattyacidoxidationinchibitorse) [15–19].

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» в течение ряда лет проводятся систематические исследования по поиску новых оригинальных p-FOX ингибиторов. В результате этих исследований в ряду α,αω-диарилметильных производных бис-(ωаминоалкил)аминов было выявлено соединение тригидрохлорид N1-(2,3,4-триметоксибензил)-N2-{2-[(2,3,4триметоксибензил)амино]этил}-1,2-этандиамина, получившее шифр АЛМ-802 (рис. 1), которое по своей кардиопротективной активности, изученной на животных с интактным сосудистым руслом, как минимум, не уступает эталонному препарату триметазидин [20].

Цель настоящего исследования – изучение влияния ЭД на кардиопротективное действие соединения АЛМ-802 и триметазидина в условиях модели субэндокардиальной ишемии у крыс.

Материалы и методы

Животные. Эксперименты выполнены на беспородных белых крысах-самцах массой 250–300 г, полученных из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», филиал «Столбовая». Животные имели ветеринарный сертификат и прошли карантин в виварии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова». Животных содержали в соответствии с приказом Минздрава России № 199 от 01 апреля 2016 года «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» и СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических

клиник (вивариев)» от 29 августа 2014 г. № 51. Все эксперименты с животными проводили в соответствии с международными правилами (EuropeanCommunitiesCouncilDirectiveofNovember 24,1986 (86/609/EEC)), а также в соответствии с «Правилами работы с животными», утверждёнными биоэтической комиссией ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. За- кусова». Животные были рандомизированы на 2 группы: 1-я – интактные крысы (n = 33); 2-я – животные, у которых моделировали ЭД (n = 29). Часть животных каждой из групп использовали для проверки адекватности модели ЭД. Остальные крысы каждой из 2 экспериментальных групп были слепым методом разделены на 3 подгруппы: интактные крысы: 1-я – контроль (n = 12); 2-я – АЛМ-802 (2 мг/кг; n = 7); 3-я – триметазидин (30 мг/кг; n = 8; крысы с ЭД: 1-я – контроль (n = 8); 2-я – АЛМ-802 (2 мг/кг; n = 8); 3-я – триметазидин (30 мг/кг, n = 8). Все препараты вводили внутривенно за 2 мин до начала инфузии изопротеренола в изотоническом растворе натрия хлорида. Раствор для инъекций готовили так, чтобы на 100 г массы животного надо было вводить 0,1 мл жидкости. Животные контрольной группы получали эквивалентный объём изотонического раствора натрия хлорида.

Экспериментальные модели:

–        Модель субэндокардиальной ишемии. Острую субэндокардиальную ишемию миокарда вызывали по методу, описанному YamamotoS, etal [21]. Для этой цели наркотизированным животным (уретан 1300 мг/кг в/б) с помощью инъектора «Линеомат» (Россия) внутривенно со скоростью 20 мкг/кг/мин вводили неселективный агонист αβ-адренорецепторов изопротеренол. Об интенсивности ишемического повреждения судили по величине депрессии сегмента ST на ЭКГ (II стандартное отведение) через 5 мин от момента начала инфузии изопротеренола. ЭКГ регистрировали с помощью компьютерного электрокардиографа «Полиспектр 8/ЕХ» (Нейрософт, Россия).

–        Модель ЭД. Для того чтобы индуцировать ЭД, у животных вызывали гипергомоцистеинемию. С этой целью крысам вводили метионин (3 г/кг внутрижелудочно 1 раз в сутки в течение 7 дней) в виде суспензии на солюбилизаторе TWIN-80 [22]. Для проверки адекватности модели у выбранных случайным образом интактных (n = 6) и получавших метионин (n = 5) крыс, наркотизированных уретаном (1300 мг/кг, в/б), регистрировали реакции АД на М-холиномиметик метахолин (0,25 мкг/кг в/в). Хорошо известно, что вазодилатация, вызываемая веществами такого типа, является эндотелий-зависимой [22]. АД регистрировали в правой сонной артерии с помощью прибора «Мингограф-82», соединённого с помощью аналого-цифрового преобразователя с персональным компьютером. С помощью программы «PhotoshopCS5» рассчитывали площадь над кривой реакции.

При проведении экспериментов использовали изотонический раствор натрия хлорида («Красфарм», Россия), уретан («AcrosOrganics», Индия), изопротеренол («Sigma», Германия), триметазидин («NiveditaChemicalsPvt. Ltd.», Индия), АЛМ-802 (ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»).

Статистическая обработка. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка, гомогенность дисперсий — с помощью критерия Левена. Так как при проверке адекватности модели ЭД выборки имели нормальное распределения, а выборочные дисперсии были негомогенны, то статистическую значимость различий определяли с помощью аппроксимации критерия Стьюдента для выборок с неравными дисперсиями. Результаты экспериментов на модели субэндокардиальной ишемии имели нормальное распределение, и выборочные дисперсии были гомогенны, в связи с этим для определения значимости различий использовали двухфакторный дисперсионный анализ (анализирумые факторы: вещество и ЭД) с последующей обработкой методом множественных сравнений по Ньюмену–Кейлсу. Полученные результаты выражали в виде средних арифметических, их стандартных ошибок и 95 % доверительных интервалов. Различия считали статистически значимыми при ошибке первого рода р ≤ 0,05. Статистическую обработку проводили с помощью программы «Biostat-2009» (серийный № 1-BsiGf-QeLFS).

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследований оценили адекватность использованной нами модели ЭД. Для этой цели определяли интенсивность эндотелий-зависимой вазодилатации, вызванной М-холиномиметиком метахолином (0,25 мкг/кг), как у интактных животных, так и у крыс, которым ежедневно в течение 7 дней вводили алифатическую серосодержащую незаменимую аминокислоту метионин. В результате трансаминирования и последующего метилирования метионина в организме образуется серосодержащая аминокислота гомоцистеин, являющаяся промежуточным продуктом обмена метионина и цистеина. Известно, что повышение содержания гомоцистеина в плазме крови (гипергомоцистеинемия) является независимым предиктором развития ЭД — подавления эндотелий-зависимой вазодилатации артерий в результате угнетения синтеза оксида азота в эндотелиальных клетках сосудов [22]. Показано, что если у интактных животных величина вызванной метахолином эндотелий-зависимой вазодилатации, которую рассчитывали по площади над кривой АД [22], равна 12,1±2,3 см2 (n = 6), то у животных, в течение 7 дней получавших метионин, она более чем в 2 раза меньше – 5,2±1,0 см2 (n = 5, р = 0,032), что позволяет говорить о наличии у последних ЭД.

Анализ результатов, полученных в экспериментах на модели субэндокардиальной ишемии, с помощью двухфакторного дисперсионного анализа позволил установить, что оба изучаемых фактора оказывают статистически значимое воздействие на депрессию сегмен- та ST, вызываемую изопротеренолом (20 мкг/кг/мин) через 5 мин от момента начала инфузии: фактор вещество – F = 27,253, df = 2, p << 0,001; фактор ЭД – F = = 31,091, df = 1, p << 0,001 (F – квантиль распределения Фишера—Снедекора; df – число степеней свободы). Также имеет место статистически значимое взаимодействие факторов (F = 3,484, df = 2, p = 0,0392). Для остаточной дисперсии df = 45.

Действительно, дальнейший статистический анализ показал, что у интактных животных как соединение АЛМ-802, так и триметазидин, препятствовали развитию депрессии сегмента ST, вызываемой изопротеренолом (20 мкг/кг/мин в/в) на 5-й минуте инфузии (таблица). Так, если в контрольной группе интактных животных депрессия сегмента ST в среднем составляла 0,159±0,017 (0,122÷0,196) мВ, то у животных, которые получали триметазидин (30 мг/кг в/в) и АЛМ-802 (2,0 мг/кг в/в), эта величина была равна 0,073±0,019 (0,028÷0,117; р = 0,0153) мВ и 0,023±0,006 (0,008÷0,038; р = 0,0015) мВ, соответственно. Как следует из полученных данных, у животных с интактным сосудистым руслом интенсивность антиишемического действия эталонного препарата триметазидин и соединения АЛМ-802 не различалась (р = 0,327).

Показано что ЭД усиливала интенсивность ишемических изменений на ЭКГ, вызываемых изопротеренолом. Так, если у интактных животных депрессия сегмента ST в среднем составляла 0,159±0,017 (0,122÷0,196) мВ, то у крыс со сформировавшейся ЭД этот показатель был равен 0,280±0,034 (0,200÷0,360; р = 0,0029) мВ. Эти результаты хорошо корреспондируются с известными данными о том, что снижение вазодилатирующей способности артерий, в том числе и коронарных, увеличивает риск ишемического повреждения тканей.

При изучении антиишемической активности эталонного препарата триметазидин и соединения АЛМ-802 в условиях сформировавшейся ЭД было показано, что если соединение АЛМ-802 уменьшало депрессию сегмента ST на ЭКГ с 0,280±0,034 мВ до 0,063±0,022 мВ (0,011÷0,114; р = 0,0001) мВ, то триметазидин статистически значимых изменений по сравнению с контролем не вызывал (0,244±0,035; 0,160÷0,327 мВ; р = 0,297). При этом вызываемая изопротеренолом депрессия сегмента ST на ЭКГ у крыс с ЭД, получавших соединение АЛМ-802, была статистически значимо меньше чем у животных, которым вводили триметазидин (р = 0,0002).

Таким образом, эндотелиальная дисфункция препятствует реализации антиишемического действия триметазидина, но не влияет на таковое соединения АЛМ-802. При изучении антиишемических свойств новых фармакологических веществ определённую часть экспериментов целесообразно проводить в модельных экспериментах, воспроизводящих эндотелиальную дисфункцию.