Подходы к прогнозированию аффинности лигандов 18 кДа транслокаторного белка TSPO с целью создания молекул с нейропсихотропной активностью человека (HUVEC)

Введение

Транслокаторный белок массой 18 кДа (TSPO) — это богатый триптофаном трансмембранный белок, состоящий из пяти α-спиралей. Он локализуется преимущественно на наружной митохондриальной мембране в стероид-синтезирующих тканях, включая ткани мозга. TSPO участвует в переносе холестерина из цитоплазмы на внутреннюю сторону митохондриальной мембраны, этот процесс является скорость-лимитирующим фактором в синтезе стероидов и нейростероидов [1].

Лиганды, связывающиеся с активным центром TSPO, облегчают трансмембранный транспорт холестерина в митохондрию, который под воздействием ферментов трансформируется в нейростероиды. Последние аллостерически связываются с ГАМКА рецептором, активируя ток анионов хлора внутрь клетки, что реализуется в дальнейшем в противотревожном эффекте [2].

На основании высокоаффинных синтетических лигандов (рис. 1) и данных, полученных нами ранее, была модифицирована известная фармакофорная модель TSPO-лигандов (рис. 2). Ядром лиганда должен являться плоский ароматический гетероцикл, в котором одно из положений замещено на ароматическое кольцо. Также в гетероцикле должна присутствовать амидная группа с липофильными заместителями, которая должна быть удалена от ядра не более чем на длину одной углерод-углеродной связи. Важно наличие карбонильной группы в липофильном фрагменте молекулы, она выступает в качестве акцептора водородной связи [3].

Несмотря на достаточно большое количество полученных лигандов TSPO, среди них (на 2018 год) нет зарегистрированных препаратов, за исключением препарата «Стрезам», однако он не одобрен FDA [14], кроме того, его механизм действия обусловлен не только взаимодействием с TSPO, но и прямым связыванием с ГАМКА рецептором. Таким образом, на сегодняшний день не найдено фармакологического решения задачи по созданию эффективных нейропсихотропных препаратов среди лигандов TSPO вследствие нежелательных побочных эффектов, недостаточной афинности к TSPO и токсичности большинства из них [15]. Вследствие этого актуальной задачей остаётся дальнейшая разработка лигандов TSPO, обладающих нейропсихотропной активностью, с отсутствием побочных эффектов и токсичности. Для решения данной проблемы в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова был синтезирован ряд соединений на основе разработанной фармакофорной модели (см. рис. 2). В качестве основного гетероцикла был выбран пирроло[1,2-a]пиразин с фенильным кольцом в 1-м положении и наличием амидной группировки в 3-м положении (рис. 3). [3].

Анализ связи структура-активность С целью анализа прогностических возможностей метода QSAR и молекулярного докинга использовались как ранее синтезированные и изученные соединения, так и новые сконструированные молекулы. Вещества с шифром ГМЛ и МЛ были синтезированы нами ранее [3], для остальных указан порядковый номер.

На основе ранее изученных соединений анализ связи структура-активность [3] показал, что наибольшую активность проявляют соединения, у которых отсутствует заместитель в бензольном кольце (R3 = H), а амидная группа замещена на метильную (R1 = CH3) и бензильную или н-бутильную группу (R2 = Bz, n-Bu). Различные вариации ортозаместителя R3 в бензольном кольце ГМЛ-2, ГМЛ-4, ГМЛ-5 при R1 = CH3,   R2 = n-Bu приводят к снижению активности. При введении фтора в положение R3 активность снижается, а при введении брома и хлора полностью исчезает. Удаление одного из заместителей у амидной группы ГМЛ-7 и ГМЛ-8 R1 или R2 = H существенно снижает активность. Замена н-бутильного остатка на более разветвленный втор-бутил также снижает активность. В результате выделены основные перспективные соединения ГМЛ-1 и ГМЛ-3, у которых отсутствует заместитель в положении R3, а амидная группа замещена по обоим атомам водорода.

Одним из ключевых параметров лигандов TSPO, определяющих их биологическую активность, является их аффинность по отношению к этому рецептору. На основании анализа связи структура-активность разработан ряд модифицированных лигандов в ряду пирроло[1,2-a]пиразинов и проведён прогноз сродства с использованием QSAR и метода молекулярного докинга. QSAR/QSPR — метод измерения количественной связи между структурой молекулы и её свойством, в нашем случае активностью. Методы QSAR появились в начале 1960-х и их основателем был Корвин Ганч. Основное применение QSAR моделей — прогноз биологической активности для химических соединений [16]. Для числового обозначения молекулы используют независимые друг от друга числовые параметры молекулы — дескрипторы. [17]

Топологические методы QSAR используют информацию о атомах и типах связи между ними, а также другие локальные дескрипторы (липофильность, константы заместителей, дипольный момент и др.) Структурная формула молекул записывается в виде молекулярного графа, где атомы — это вершины, а ребра — это связи между атомами. Однако топологический подход не позволяет учитывать информацию о взаимном расположении структурных особенностей в пространстве и такие методы не могут быть универсальным инструментом прогнозирования физиологической активности.

Для построения QSAR моделей формируется обучающая и тестовая выборка из молекул, для которых заранее известна биологическая активность. Обучающая выборка загружается в компьютерную программу, которая проводит подбор дескрипторов и строит зависимость как:

А = f(D), где

A – активность, D – дескриптор.

На основе обучающей выборки строится корреляционное уравнение активности от набора дескрипторов. Модель проверяется с помощью тестовой выборки, в которой активность молекул уже известна. Таким образом, модель связывает активность с определенными фрагментами в молекуле и их окружением. Точность модели зависит от размера обучающей выборки и оптимального набора дескрипторов [18]. Для прогнозирования аффиности лигандов к TSPO построена QSAR модель на основе обучающей выборки из 1 297 лигандов TSPO с известной константой ингибирования. Первоначально осуществляли поиск лигандов TSPO с известными константами ингибирования в базе данных химических структур ZINC [19]. Полученную базу в формате sdf загрузили в веб-сервис для QSAR моделирования — OCHEM [20]. Было создано 9 моделей из комбинации трёх методов машинного обучения (ASNN, FSMLR, PLS) с различным набором 2D фрагментарных дескрипторов (OEState, ISIDA, GSFrag). Для валидации модели использовался 5-кратный перекрёстный контроль (табл. 1).

В результате была выбрана модель на основе искусственных нейронных сетей от фрагментарных дескрипторов ISIDA с коэффициентом корреляции R2 = 0,68 (Таблица и параметром перекрестного контроля q2 = 0,65. Для промежуточной оценки модели использовали значение RMSE (rootmeansquarederivative) среднеквадратичного отклонения и параметра перекрёстного контроля Q2 (рис. 4).

Фрагментарные дескрипторы ISIDA базируются на двух классах дескрипторов: подструктурные молекулярные фрагменты и фармакофорные триплеты. Первые разбиты на три класса:

1.               Последовательность соединенных атомов и связей.

2.               Только атомы или пары атомов.

3.               Расширенный набор атомов с близкой средой и их связей.

Фармакофорные триплеты производят поиск и выделение определённых фармакофорных фрагментов (H-доноры, H-акцепторы, анионы, катионы и т. д.) на заданных топологических расстояниях.

В результаты были получены прогнозируемые значения аффиности для 22 структур с различными заместителями у амидной группы (табл. 2).

Молекулярный докинг

Молекулярный докинг — это метод моделирования, который позволяет предсказать наиболее выгодную для образования устойчивого комплекса ориентацию и положение одной молекулы по отношению к другой. В данной статье мы использовали метод взаимодействия лиганд-рецептор. Сначала выбрали рецептор с нативным лигандом в PDB и выполнили подготовительные преобразования, затем взяли как ранее синтезированные и изученные лиганды, так и сконструировали несуществующие, но легко синтезируемые по отработанной методике. Для построения 3D моделей молекул была выбрана программа MarvinSketch, входящая в программный пакет Marvin от компании ChemAxon. Рецептор TSPO домовой мыши был взят из PDB (proteindatabank) шифр 2MGY [21]. Данный белок получен путём экспрессии ДНК-последовательности TSPO мыши в кишечной палочке. Аминокислотная последовательность транслокаторного белка человека от белка мыши отличается наличием полиморфизма генов rs6971 у человека. Этот однонуклеотидный полиморфизм заключается в замене аланина в 147-м положении на треонин [22].

Предварительно в программе AutoDockTools [23] в структуру рецептора добавили водороды, удалили нативный лиганд PK 11195 и посчитали заряд по методу Gaisteger [24]. Аналогичную процедуру проводили с лигандами. Затем нами были построены электростатические решетки для N-терминального кармана связывания. Молекулярный докинг проводили с помощью программы AutoDock 4.2. Конформационный поиск в активном центре выполнялся по генетическому алгоритму.

Для проверки правильности подсчёта скорингфункции проводили докинг с 4 известными высокоаффинными лигандами транслокаторного белока (табл. 3).

После проведения проверки приступили к основной процедуре докирования. Аффиность лигандов к TSPO колебалась от мкМ до нМ значений. Наилучшие Ki наблюдали для соединений 6, 7, 8, ГМЛ-11,11 (табл. 4).

Дальнейшему анализу подвергали самые аффинные соединения 6, 7, 8, ГМЛ-11, 11 и соединения с ClogP < 4,5: ГМЛ-21, ГМЛ-22, ГМЛ-1, 4. В результате докинга определилось два основных мотива связывания. В одном мотиве пирролопиразиновый остов наиболее аффинных соединений ГМЛ 11 и 8 гидрофобно взаимодействует с ароматическими остатками триптофана (95 ,107), аланина (110, 147) и лейцина 150, а липофильные заместители амидной группы – с лейцином 150, серином 41, триптофаном 143, изолейцином 52. Фенильное кольцо у гетероароматического остова располагается около двух остатков триптофана 53 и 95 (рис. 5). Соединение ГМЛ 22 имеет похожий мотив связывания, однако фенильное кольцо в гетероцикле несколько сдвинуто к остатку триптофана 143 (см. рис. 5), в отличие от соединений ГМЛ-11 и 8, которые не могут сдвинуться из-за наличия объёмных заместителей у амидной группы.

Альтернативный мотив связывания предсказан для структур ГМЛ-21, ГМЛ-1, 4, 6, 11. В отличие от соединений ГМЛ-22, ГМЛ-11, 8 гетероциклический остов молекул ГМЛ-1 и 7 (Рис. 6) взаимодействует с остатками триптофана (53,143), изолейцина 52 и аланина 23. Однако у соединений ГМЛ-21, 4, 11 фенильное кольцо сдвигается в сторону стэкинг взаимодействия с триптофаном 107, что в итоге сдвигает пирролопиразиновый цикл к остатку триптофана 95 и лейцина 114 (рис. 6). У амидного атома азота соединений ГМЛ-1 и 7 положения бензильной группы совпадают, а насыщенные атомы углерода направлены к лейцину 49. Этильный радикал у амидного азота соединения 4 также направлен к лейцину 49, а бензильная группа — к валину 26. Соединение ГМЛ-21 тоже несколько сдвинуто по метильному радикалу к остатку лейцина 49. Нафтильная группа в соединении 11 имеет дополнительную область связывания с валином 26, лейцином 31, серином 41 и аргинином 46. Таким образом, введение электроноакцепторной группы в параположение фенильного кольца у атома амидного азота может увеличить сродство к TSPO.

По причине того, что карман активного центра PK-11195 достаточно гидрофобен, проведён анализ соответствия гидрофобной поверхности лиганда к поверхности белка с помощью веб-сервиса PLATINUM. В этом веб-сервисе проводятся вычисления, основанные на концепции молекулярного гидрофобного потенциала, который присваивается каждому атому в зависимости от его природы. Затем проводится анализ поверхности молекулы лиганда и его окрестностей. Результат — это число, полученное при делении гидрофобно комплементарной поверхности лиганда к белку на общую поверхность лиганда. Также на основе эмпирических функций ведётся учёт – стэкинговых взаимодействий между ароматическими остатками аминокислот и ароматическими фрагментами лигандов. Результаты исследуемых структур сравнивали с результатами классического лиганда TSPO PK-11195 (табл. 5). В итоге вышеперечисленных прогнозов, принимая во внимание коэффициент clogP и результаты соответствия гидрофобных поверхностей. Соединения ГМЛ-23, 5, 7, ГМЛ-11, 8 не подходят к правилу Липински clogP < 5 [25]. Оптимальные значения logP для проникновения через гематоэнцефалический барьер лежат в интервале 1,5-2,7 [26]. Таким образом, перспективными соединениями, учитывая липофильность, аффиность и гидрофобный потенциал, стали соединения ГМЛ-21, ГМЛ-22, ГМЛ-1, 4.

Выводы

В результате данной работы были спрогнозированы перспективные соединения — лиганды транслокаторного белка. Часть соединений в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова уже была изучена ранее и была включена в выборку для проверки методов молекулярного моделирования (табл. 6).

Расчётные данные для ГМЛ-21, ГМЛ-22, ГМЛ-23, ГМЛ-1 соотносятся с результатами эксперимента, кроме ГМЛ-11, который проявил анксиолитическую активность, несмотря на несоответствие правилу Липнински.