Исследование протекторных свойств агониста TrkA-рецептора ГК-2 на модели окислительного стресса в культуре клеток сосудистого эндотелия человека (HUVEC)

Введение

Хронические ишемические состояния, в том числе ишемическая болезнь сердца и хроническая ишемия нижних конечностей лидируют в структуре летальности и инвалидизации. Одним из возможных подходов к лечению этих состояний является использование биоподобных фармакологических агентов, способных посредством стимуляции ангиогенеза обеспечить адекватное кровоснабжение ишемизированных тканей. Такое направление терапии получило название терапевтический ангиогенез или биологическое шунтирование [1]. Наиболее перспективным в этом направлении представляется разработка и внедрение в клиническую практику экзогенных аналогов эндогенных факторов роста [2]. Известно, что фактор роста нервов (NGF) помимо центральной нервной системы синтезируется и экскретируется эндотелиальными и гладкомышечными клетками сосудов, а на их клеточной мембране имеются специфичные для NGFTrkA рецепторы, через которые реализуются его ангиогенные эффекты [3]. В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова синтезирован димерный дипептидный миметик 4 петли NGF – соединение ГК-2, обладающий свойствами агониста TrkA рецепторов [4]. Ранее нами в экспериментах, выполненных на культуре клеток эндотелия человека (HUVEC), было показано, что ГК-2 проявляет выраженную ангиогенную активность, соизмеримую с таковой у NGF [5].

Цель исследования

Целью настоящей работы было исследование ангиопротекторных свойств димерного дипептидного миметика 4-й петли NGF ГК-2 в условиях окислительного стресса на культуре клеток эндотелия человека – HUVEC.

Материалы и методы

Для экспериментов использовались реактивы: среда ДМЕМ (HyClone), фетальная бычья сыворотка FBS (Gibco), L-глутамин (ICN) HEPES (ICN), гепарин (Панфарма), желатин (БиолоТ), ECGF (SigmaAldrich), MTT (SigmaAldrich), ДМСО (Panreac), PBS (SigmaAldrich).

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека HUVEC культивировали в среде ДMEM с добавлением 20мМ буфера HEPES, 5 ЕД/мл гепарина, 200 мкг/мл ECGF, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) при 37 C в атмосфере, содержащей 5 % CO2. Клетки рассеивались в 96-луночные планшеты, покрытые желатином, с плотностью 5 тыс. клеток на лунку. Через 24 ч инкубации добавляли перекись водорода (HO ) в конечной концентрации 200 мкМ. Спустя 24 ч культуральную среду, содержащую H2O2, заменяли на нормальную, вносили NGF в качестве положительного контроля в конечной концентрации 100 нг/мл (10–9М) и ГК-2 (10–6М). Затем NGF и ГК-2 вносили каждые 48 ч в течение 6 суток. Через 24 ч после последнего внесения оценивали жизнеспособность клеток и количество клеток с нарушенной структурой хроматина. Жизнеспособность клеток измеряли с использованием MTT-теста. По окончании эксперимента среду отбирали, добавляли 0,5 % раствор 3-(4,5-диметилтиазол2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (MTT) в PBS, содержащем 0,9 мМ CaCl2 и 0,5 мМ MgCl2. Для растворения образующихся кристаллов формазана использовали ДМСО. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре MultiscanEX при длине волны 600 нм [6]. Количество клеток с нарушенной структурой хроматина определяли после окрашивания ядерным красителем Хёхст 33258 (1 мкг/мл) в течение 30 мин. Клетки фотографировали при увеличении 200х с помощью микроскопа NikonEclipseTS100-F (Япония) при длине волны возбуждения 340–380 нм и длине волны испускания 435–485 нм. Подсчитывали количество клеток с измененной структурой хроматина в 5 полях зрения в каждой лунке (24 лунки в каждой экспериментальной группе).

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом по Данну (ANOVA). Данные представлены в виде m. ± s.d. Данные считались достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Для моделирования окислительного стресса использовали Н2О2 (200 мкМ), которая согласно литературным данным стимулирует программируемую гибель клеток – апоптоз [7], сопровождающуюся рядом биохимических и морфологических изменений в клетке: конденсация хроматина, фрагментация ДНК, повышение проницаемости мембран, сжатие клетки. Показано, что окислительный стресс приводил к достоверному снижению жизнеспособности клеток по сравнению с контролем (78 ± 5 и 100 ± 6 % соответственно, р < 0,05) (табл. 1).

NGF (10–9М) и ГК-2 (10–6М) в условиях окислительного стресса проявляли выраженную цитопротекторную активность, предотвращая снижение жизнеспособности клеток HUVEC под действием H2O2 (95 ± 3 % для ГК-2 и 97 ± 4 % для NGF против 78 ± 5 % для H2O2, р  0,05). Поскольку данная концентрация перекиси водорода вызывает, по литературным данным, повреждение хроматина ядра клетки, проводили окрашивание ядерным красителем Хёхст 33258.

В контроле количество клеток с конденсированным хроматином составило 9 ± 2, после внесения Н2О2   78 ± 9 (р  0,05 по сравнению с контролем). NGF или ГК-2 внесенные после Н2О2 достоверно снижали число таких клеток (44 ± 9 и 41 ± 8 соответственно) (р  0,05 по сравнению с перекисью водорода) и препятствовали развитию морфологических изменений ядерного хроматина (рис. 1а, 1б).

Таким образом, ГК-2, подобно NGF, в условиях окислительного стресса не только препятствует снижению жизнеспособности эндотелиальных клеток HUVEC, но и предотвращает повреждение ядерного хроматина.

Конденсация хроматина — это наиболее характерное проявление апоптоза. Хроматин конденсируется по периферии, под мембраной ядра, при этом образуются чётко очерченные плотные массы различной формы и размеров. Ядро может разрываться на два или несколько фрагментов. Механизм конденсации хроматина обусловлен расщеплением ядерной ДНК в местах, связывающих отдельные нуклеосомы, что приводит к развитию большого количества фрагментов. Ранее нами было показано, что внесение как ГК-2, так и NGF в культуру гиппокампальных клеток линии НТ-22 приводило к синтезу белков HSP70 [8]. Хорошо известно, что увеличение содержания HSP70 приводит к возрастанию уровня антиапоптотических белков Bcl-2 и снижению проапоптотических Bax [9]. Кроме того, HSP70 блокирует вовлечение прокаспазы-9 в апоптосомы, а также саму каспазу-9 [10]. HSP70 может связываться с эндонуклеазой EndoG и блокировать транслокацию этого проапоптотического фактора в ядро [11]. Таким образом, антиапоптотическое действие ГК-2 может быть опосредовано его влиянием на синтез белков теплового шока HSP70, являющихся основным звеном защиты клеток от повреждений, в том числе вызванных окислительным стрессом.

Вывод

Димерный дипептидный миметик 4-й петли NGF — соединение ГК-2, подобно NGF, в культуре клеток эндотелия человека HUVEC препятствует развитию процесса апоптоза, вызванного окислительным стрессом.