Исследование влияния положения метокси-группы на кардиотропную активность соединения АЛМ-802

Введение

Поиск и создание новых оригинальных лекарственных средств, обладающих антиаритмическим действием и способных при этом оптимизировать метаболические процессы в ишемизированном миокарде, представляется актуальной задачей. В настоящее время в клинической практике активно используются препараты триметазидин [1] и ранолазин [2], обладающие свойствами ингибиторов окисления свободных жирных кислот (рис. 1). Эти лекарственные средства облают высокой антиишемической и антиаритмической активностями, и они успешно применяются при лечении ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, метаболического синдромом, алкогольной кардиомиопатии и других заболеваний сердца [3–6].

Дизайн и синтез

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» ранее на основе фармакофорной модели, комбинирующей структурные элементы триметазидина и ранолазина, было сконструировано соединение АЛМ-802 (тригидрохлорид N1–(2,3,4-триметоксибензил)-N2–{2-[(2,3,4-триметоксибензил)амино]этил}-1,2-этандиамина) (рис. 2). Данная молекула содержит два ароматических фармакофора (выделено красным) и связывающий их триазаалкановый линкер (выделено синим).

Исследование кардиотропной активности соединения АЛМ-802 продемонстрировало высокую перспективность этого соединения. В условиях модели субэндокардиальной ишемии у крыс вещество АЛМ-802 (1,0 мг/кг в/в) продемонстрировало выраженную антиишемическую активность, что выражалось в отсутствии депрессии сегмента ST на электрокардиограмме крыс по сравнению с контрольной группой. В этой же дозе (в/в) АЛМ-802 проявило антиаритмическую активность на моделях аконитиновой аритмии, хлоридкальциевой аритмии и электрической фибрилляции.

С целью оценки влияния строения молекулы АЛМ-802 на его биологическую активность в настоящей работе нами было синтезировано соединение АЛМ-803 (тригидрохлорид N1–(3,4,5-триметоксибензил)-N2–{2-[(3,4,5-триметоксибензил)амино]этил}-1,2этандиамина), отличающееся от АЛМ-802 перемещением орто-метокси-групп во вторые мета-положения (рис. 3). Синтез соединения АЛМ-803 осуществлялся путём восстановительного аминирования 3,4,5-триметоксибензальдегида с диэтилентриамином в соотношении 2:1, соответственно, в этаноле. Восстановление осуществляли путём каталитического гидрирования на палладиевом катализаторе. Выход продукта составил 48 %. Т.пл. 192–195 С (с разл.). Данные элементного анализа соответствовали расчетной брутто формуле C24H40Cl3N3O6H2O. Спектр ЯМР 1Н (DMSO,  м.д.): 3.24-3.47 (м, 8 Н, ((СН2)2)2N),3.56, 3.80 (два с, 6 Н и 12 Н, 6 ОМе), 4.15 (с, 4 Н, 2 СН2Ar),7.00 (с, 4 Н, 4 ArH), 9.82 (уш.с, 3 Н, 3 NH).

Материалы и методы

Животные. В экспериментах по оценке острой токсичности соединений использовали беспородных мышей-самцов с массой тела 21–24 г. В экспериментах по оценке антиишемической и антиаритмической активности соединений использовали белых беспородных крыссамцов массой 160–420 г. Все животные были получены из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», филиал «Столбовая». Животных содержали в соответствии с приказом Минздрава России № 199 от 01 апреля 2016 года «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» и СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29 августа 2014 г. № 51. Все эксперименты с животными проводили в соответствии с международными правилами (EuropeanCommunitiesCouncilDirectiveofNovember 24,1986 (86/609/EEC)), а также в соответствии с «Правилами работы с животными», утверждёнными биоэтической комиссией ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Определение LD50. Значения LD50 соединений изучали на беспородных мышах-самцах при внутрибрюшинном введении. В качестве растворителя использовали апирогенную воду для инъекций. LD50 определяли в пяти различных дозах, количество животных в каждой серии 6. Летальность животных оценивали через 24 часа после введения соединений. Значения LD16, LD50 и LD84 с их доверительными 95 % интервалами рассчитывали по методу Литчфилда-Вилкоксона.

Модель субэндокардиальной ишемии у крыс, вызываемой изопротеренолом

Антиишемическую активность соединений изучали на белых беспородных крысах-самцах массой 250–300 г, наркотизированных уретаном (1 300 мг/кг, в/б). Острую субэндокардиальную ишемию миокарда вызывали по методу, описанному YamamotoS, etal. [7]. Для этой цели животным с помощью инъектора «Линеомат» (Россия) внутривенно со скоростью 20 мкг/кг/мин вводили неселективный агонист -адренорецепторов изопротеренол. Об интенсивности ишемического повреждения судили по величине депрессии сегмента ST на ЭКГ (II стандартное отведение) через 5 минут от момента начала инфузии изопротеренола. В качестве регистратора использовали компьютерный электрокардиограф «Полиспектр 8/ЕХ» (Нейрософт, Россия).

Животные были рандомизированы на 3 группы: 1-я — контроль (n = 16), 2-я — соединение АЛМ-802 (n = 7), 3-я — соединение АЛМ-803 (n = 6). Животным контрольной группы за 2 минуты до начала инфузии изопротеренола внутривенно вводили эквивалентный объём (0,2 мл) физиологического раствора, а животные основных групп по аналогичной схеме получали исследуемые соединения (1 мг/кг, в/в).

Модель аконитиновой аритмии [8, 9]

Опыты проводили на беспородных наркотизированных (уретан 1 300 мг/кг, в/б) крысах-самцах массой тела 160–180 г. Животных переводили на искусственное дыхание. Регистрировали ЭКГ во II стандартном отведении. В качестве регистратора использовали Mingograf-82 фирмы Elema-Siеmens (Швеция). Визуальный контроль регистрируемых параметров в течение всего эксперимента производили при помощи 8-канального осциллоскопа фирмы NihonKonden (Япония). Животных рандомизировали на 3 группы: 1-я – контроль (n = 11), 2-я – соединение АЛМ-802 (n = 8), 3-я – соединение АЛМ-803 (n= 6). В контрольной серии экспериментов определяли минимальную дозу аконитина, вызывающую фатальные нарушения ритма сердца в первые 5 минут от момента его внутривенного введения. Животным опытных групп за 2 минуты до инъекции аконитина вводили исследуемые соединения (1 мг/кг, в/в). В каждой опытной группе оценивали количество погибших животных в первые 5 минут после введения аконитина.

Модель хлоридкальциевой аритмии [8, 9]

Опыты проводили на беспородных наркотизированных (уретан 1300 мг/кг, в/б) крысах-самцах массой тела 250–300 г. Животных переводили на искусственное дыхание. Регистрировали ЭКГ во II стандартном отведении. В качестве регистратора использовали Mingograf-82 фирмы Elema-Siеmens (Швеция). Визуальный контроль регистрируемых параметров в течение всего эксперимента производили при помощи 8-канального осциллоскопа фирмы NihonKonden (Япония). Животные были рандомизированы на 3 групп: 1-я — контроль (n = 10), 2-я — соединение АЛМ-802 (n = 6), 3-я — соединение АЛМ-803 (n = 6). В контрольной серии экспериментов определяли минимальную дозу кальция хлорида, вызывающую фатальные нарушения ритма сердца в первые 5 минут от момента его внутривенного введения. Животным опытных групп за 2 минуты до инъекции кальция хлорида вводили исследуемые соединения (1 мг/кг, в/в). В каждой опытной группе оценивали количество погибших животных в первые 5 минут после введения кальция хлорида.

Модель электрической фибрилляции желудочков сердца [8]

Опыты проводили на анестезированных (уретан, 1300 мг/кг, в/б) беспородных крысах-самцах массой тела 380–420 г. Животных переводили на искусственное дыхание, проводили стернэктомию и перикардотомию. В миокард левого желудочка сердца на расстоянии 3–5 мм друг от друга имплантировали два позолоченных электрода. Порог электрической фибрилляции сердца определяли сканированием уязвимого периода серией из 20 прямоугольных импульсов постоянного тока увеличивающейся интенсивности (длительность импульса 4 мс, частота 50 имп/с) до возникновения фибрилляции. За порог фибрилляции принимали минимальную силу тока, стабильно вызывающую фибрилляцию желудочков при повторной стимуляции. В опыт отбирали только тех животных, у которых фибрилляция желудочков наступала при силе тока не более 6 мА.

В работе использовали электростимулятор HSEStimulatorII (HugoSachElectronik, Германия). В течение всего эксперимента регистрировали ЭКГ (II стандартное отведение). В качестве регистратора использовали электрокардиограф ЭК 4Т-02 (Россия). Визуальный контроль регистрируемых параметров в течение всего эксперимента производили при помощи 4-канального осциллоскопа фирмы Elema-Simiens (Швеция). Животных рандомизировали на 3 группы: 1-я – контроль (n = 6), 2-я — соединение АЛМ-802 (n = 6), 3-я — соединение АЛМ-803 (n = 6). Исследуемые соединения (1 мг/кг, в/в) вводили за 5 минут до определения порога электрической фибрилляции желудочков сердца.

Статистика

При анализе данных, полученных при исследовании антиишемической активности соединений, нормальность распределения оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка. Статистическую значимость различий между группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с дальнейшей обработкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони. Различия считали значимыми при P< 0,05, критерий двухсторонний. Полученные результаты выражали в виде среднего арифметического и его стандартной ошибки. При анализе антиаритмической активности статистическую обработку проводили по методу точной вероятности Фишера с учётом множественности сравнений, а при анализе антифибрилляторной активности — с использованием знаково-рангового критерия Вилкоксона.

Результаты и их обсуждение

Исследование острой токсичности соединения АЛМ-803 показало, что значение LD50 для него составило 131,1 мг/кг, что близко по значению к данному показателю для АЛМ-802 (118,8 мг/кг) (табл. 1).

Исходя из данных по токсичности в качестве дозы для изучения кардиотропной активности соединения АЛМ-803 была выбрана такая же, в которой ранее изучали АЛМ-802, а именно, 1 мг/кг.

В модели субэндокардиальной ишемии у крыс, вызываемой изопротеренолом, соединение АЛМ-803, в отличие от АЛМ-802, не проявило статистически значимого антиишемического эффекта, что свидетельствует о том, что наличие метокси-группы в орто-положении ароматических фрагментов молекулы является критически важным для этого вида активности (табл. 2).

При исследовании антиаритмической активности было установлено, что на модели аконитиновой аритмии соединение АЛМ-803, в отличие от соединения АЛМ-802, не обладает антиаритмическим эффектом (см. табл. 2). В то же время, на модели хлоридкальциевой аритмии оба соединения обладали равной и выраженной антиаритмической активностью. Также оба вещества обладали высокой антифибрилляторной активностью, увеличивая порог электрической фибрилляции желудочков сердца у крыс до значений выше 10 мА (см. табл. 2).

Таким образом, перенос метокси-групп из ортоположения фенильных колец молекулы АЛМ-802 в мета-положения соединения АЛМ-803 приводит к исчезновению антиишемической активности и антиаритмической активности в модели аконитиновой аритмии, при этом антиаритмическая активность в моделях хлоридкальциевой аритмии и электрической фибрилляции желудочков сердца сохраняется. Данное наблюдение можно предположительно объяснить следующим образом. Молекула АЛМ-802 может рассматриваться как соединение с многокомпонентным механизмом действия: антиангинальный компонент от прототипа триметазидина и ранолазина и антиаритмический компонент от ранолазина и антиаритмиков IV класса, например, верапамила [10]. Действительно, соединение АЛМ-802 имеет структурное сходство с молекулой верапамила, в которой имеется два 3,4-диметоксифенильных фармакофора, соединенных линейным линкером (рис. 4).

В молекуле АЛМ-803 сохраняется ключевой структурный компонент верапамила, однако в ней отсутствуют, вероятно, критические для наличия антиишемической активности орто-метокси группы, которые имеются как в триметазидине, так и в ранолазине. В результате АЛМ-803 проявляет антиаритмическую активность в моделях хлоридкальциевой аритмии и электрической фибрилляции, что характерно для антиаритмиков IV класса, к которым относится верапамил.

Выводы

Синтезировано новое соединение АЛМ-803 (тригидрохлорид N1–(3,4,5-триметоксибензил)-N2–{2-[(3,4,5-триметоксибензил)амино]-этил}-1,2-этандиамина) – аналог АЛМ-802, отличающийся от него положением метокси-групп в фенильных кольцах. Установлено, что это структурное изменение приводит к исчезновению антиишемической активности и антиаритмической активности на модели аконитиновой аритмии у крыс, но при этом антиаритмическая активность на моделях хлоридкальциевой аритмии и электрической фибрилляции желудочков сердца крыс сохраняется (1 мг/кг, внутривенно). Сделано предположение о том, что наблюдаемое изменение спектра кардиотропной активности при переходе от АЛМ-802 к АЛМ-803 обусловлено критичностью наличия орто-метокси групп для антиишемической активности веществ и присутствием ключевого структурного компонента антиаритмика IV класса верапамила в обоих молекулах.