Перейти к:
Повреждённость ДНК в клетках миокарда крыс с экспериментальной алкогольной кардиомиопатией: модифицирующие эффекты фабомотизола и триметазидина
https://doi.org/ 10.24411/2587-7836-2018-10012.
Аннотация
Ключевые слова
Для цитирования:
Жанатаев А.К., Мирошкина И.А., Цорин И.Б., Чайка З.В., Крыжановский С.А., Дурнев А.Д. Повреждённость ДНК в клетках миокарда крыс с экспериментальной алкогольной кардиомиопатией: модифицирующие эффекты фабомотизола и триметазидина. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2018;(2):28-35. https://doi.org/ 10.24411/2587-7836-2018-10012.
For citation:
Zhanataev A.K., Miroshkina I.A., Tsorin I.B., Chayka Z.V., Kryzhanovskii S.A., Durnev A.D. Dna damage in myocardial cells of rats with experimental alcoholic cardiomyopathy: modifyng effects of fabomotizole and trimetazidene. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2018;(2):28-35. (In Russ.) https://doi.org/ 10.24411/2587-7836-2018-10012.
Введение
Алкогольная кардиомиопатия (АКМП) – специфический вид дилатационной кардиомиопатии, возникающей вследствие токсического поражения сердечной мышцы при чрезмерном и длительном потреблении алкоголя [1]. Несмотря на распространённость заболевания, до настоящего времени не разработаны эффективные схемы её терапии, что связано, прежде всего, с отсутствием соответствующих трансляционных моделей, позволяющих изучить тонкие механизмы патогенеза АКМП и разработать патогномоничные средства терапии [1, 2]. Новые возможности исследований появились с внедрением новой инновационной трансляционной экспериментальной модели, достаточно полно воспроизводящей клиническую картину АКМП [3].
Возможные механизмы кардиомиопатогенного действия включают действие этанола и его метаболита ацетальдегида на транспорт и связывание кальция, функцию митохондрий, метаболизм липидов, синтез белка кардиомиоцитами, активность миофибриллярной АТФ-азы и т. д. [2, 4]. Патофизиологическим следствием указанных процессов является индукция окислительного стресса и активация внутриклеточных сигнальных каскадов, вовлечённых в клеточную гибель, одним из звеньев которых и, соответственно, биомаркёром, может служить повреждённость ДНК [4, 5].
Ранее было показано, что агонист сигма-1 рецептора, анксиолитик, цитопротектор и антимутаген фабомотизол (афобазол) и p-Fox ингибитор, кардиопротектор триметазидин уменьшают ремоделирование правого и левого желудочков сердца и увеличивают его сократительную функцию в условиях сформировавшейся АКМП в трансляционной модели у крыс [6]. Целью настоящего исследования явилась изучение повреждённости ДНК в клетках миокарда крыс со сформировавшейся АКМП с оценкой влияния на регистрируемые показатели фабомотизола, триметазидина и их комбинаций.
Материалы и методы
Опыты проводили на беспородных белых крысах-самцах начальной массой 180–200 г, которые содержались в виварии в соответствии с приказом МЗ РФ № 267 от 09.06.2003 г. «Об учреждении правил лабораторной практики» с представлением брикетированного корма adlibitum при регулируемом 12/12 световом режиме. На первом этапе животных рандомизировали на две группы: интактные крысы, получавшие обычный рацион питания и животные, которые в принудительном порядке подвергались алкоголизации с использованием в качестве единственного источника жидкости 10 % водного раствора этанола в течение 24 недель – периода, необходимого для формирования у них дилатационной алкогольной кардиомиопатии. На протяжении всего исследования еженедельно регистрировали количество потребляемого этанола (г/кг). Для дальнейших экспериментов были отобраны крысы, активно потребляющие физиологически значимое количество 10 % раствора этанола, составляющего в пересчёте на чистый 5,0–6,5 г/кг в сутки. Через 24 нед. животным прекращали доступ к алкоголю, переводили на обычный рацион питания и рандомизировали их на 4 группы: алкоголизированный контроль; триметазидин (20 или 30 мг/кг/сут., в/б, 28 дней); фабомотизол (15 мг/кг/сут., в/б, 28 дней); триметазидин (20 мг/кг/сут., в/б, ежедневно на протяжении 28 дней) + фабомотизол (10 мг/кг/сут., в/б, 28 дней). Животные группы алкоголизированного контроля по аналогичной схеме получали инъекции 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида. Через сутки после последней инъекции исследуемых препаратов и эхокардиографической верификации кардиомиопатии животных умерщвляли и выделяли сердца.
Метод ДНК-комет проводили в щелочной и нейтральной версиях в соответствии с рекомендациями [7, 8]. Сердечную мышцу измельчали препаративными ножницами, дважды отмывали в 3 мл охлаждённого до 4 0С фосфатно-солевого буфера (ФСБ), содержащего 20 мМ EDTA-Na2 и 10 % ДМСО (рН 7,5), переносили в стеклянные пробирки с 3 мл того же буфера и раздавливали стеклянной палочкой. Пробирки выдерживали 5 мин для осаждения крупных фрагментов, после чего 1,5 мл верхнего слоя переносили в новую пробирку. Суспензии клеток в объёме 60 мкл вносили в пробирки с 240 мкл 0,9 % раствора лёгкоплавкой агарозы (темп. плав. < 420 0C) в ФСБ, подогретым до 410 0С (микротермостат «Термит», Россия) и ресуспендировали. Затем 60 мкл раствора агарозы с клетками наносили на предварительно покрытые 1 % универсальной агарозой предметные стекла, покрывали покровным стеклом и помещали на лёд. Покровные стекла осторожно удаляли, микропрепараты помещали в стеклянную кювету (тип Шиффендекер), заливали предварительно охлаждённым до 4 0С лизирующим буфером (10 мМ Tris-HCl [pH 10], 2,5 М NaCl, 100 мМ EDTA-Na2, 1 % TritonX-100, 10 % ДМСО) и инкубировали не менее 1 ч.
В щелочной версии метода после окончания лизиса микропрепараты переносили в камеру для электрофореза (SubCellGT, “Bio-Rad”) с раствором 300 мМ NaOH, 1 мМ EDTA-Na2, pH > 13) и инкубировали в течение 20 мин для реализации щелочно-лабильных сайтов и щелочной денатурации ДНК. Далее проводили электрофорез в течение 20 мин при напряжённости поля 1V/cm и силе тока ~ 300 mA. В нейтральной версии метода микропрепараты переносили в камеру для электрофореза с буфером 90 мМ Tris-borate, 2 мМ EDTA-Na2 (рН 7,5 ) и проводили электрофорез в течение 10 мин при напряжённости поля 1 V/cm. В обоих случаях по окончанию электрофореза микропрепараты переносили в стеклянную кювету и фиксировали в 70 % растворе этилового спирта в течение 15 мин. После фиксации микропрепараты высушивали и хранили до анализа при комнатной температуре.
Микропрепараты окрашивали флуоресцирующим красителем SYBRGreenI (1:10000 в ТЕ-буфере с 50 % глицерином, рН 8,5) в течение 20 мин. Анализ проводили на эпифлуоресцентном микроскопе Микмед-2 12T («Ломо», Россия), совмещённом с цифровой камерой высокого разрешения (VEC-335, «ЭВС», Россия), при увеличении ×200. Изображения ДНК-комет анализировали с использованием программного обеспечения CASP 1.2.2. В качестве показателя повреждённости ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (% ДНК в хвосте). В отдельную категорию выделяли клетки с показателем % ДНК в хвосте > 75 %, т. н. атипичные ДНК-кометы (ghostcells) – клетки с высокой степенью фрагментации ДНК (рис. 1). Подсчитывали их процентное содержание к общему числу проанализированных клеток. Статистическую обработку проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений с использованием критерия Даннета (% ДНК в хвосте) и критерия χ2 (% атипичных ДНК-комет).
Оценку апоптоза на парафиновых срезах миокарда проводили методом мечения терминальной трансферазой (TUNEL). Выделенные из грудных клеток сердца крыс фиксировали в 10 % забуференном растворе формалина. После окончания фиксации и стандартной проводки препараты сердец заливали в парафиновые блоки. Готовили гистологические срезы толщиной 5 мкм, которые помещали на стекла с полилизиновым покрытием и проводили стандартную процедуру депарафинирования [9]. Демаскирование проводили нагреванием срезов в 200 мл 0,01 М цитратного буфера (рН 6), содержащего 0,1 % TritonX-100, в микроволновой печи в течение 45 с при мощности излучения 1000 ватт. По окончанию препараты охлаждались добавлением 80 мл дистиллированной воды и дважды отмывались в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) и однократно дистиллированной водой. На каждый препарат наносили 50 мкл реакционной смеси, включающей 1,5 ед. терминальной трансферазы TdT (NEB), 0,25 мМ хлорида кобальта и 10 мкмоль TAMRA-dUTP (ДНК-синтез) в 1Х реакционном буфере для TdT. Препараты накрывали покровным стеклом и помещали во влажную камеру и инкубировали 1 ч при 37 0С. Далее препараты дважды отмывались дистиллированной водой. Ядра кардиомиоцитов контрастировали красителем SYBRGreenI. Микроскопирование проводили на микроскопе AxioImagerM2 (CarlZeiss) с фильтрами для FITC (SYBRGreenI) и родамина (TAMRA). Совмещённые по обоим каналам цифровые изображения (merge) получали с помощью камеры AxioCamMrm в программной среде AxioVision (рис. 2). Анализировали 10 полей зрения на каждом препарате при увеличении ×1000. Количественный анализ интенсивности апоптоза проводили методом расчёта индекса апоптоза, представляющего собой отношение числа TUNEL-позитивных ядер к общему числу кардиомиоцитов. Статистическую обработку проводили с помощью критерия χ2.
Результаты и обсуждение
В табл. 1 представлены результаты оценки в щелочной версии метода ДНК-комет повреждённости ДНК клеток миокарда крыс со сформировавшейся АКМП на фоне 28-дневной абстиненции и влияние на наблюдаемые эффекты афобазола и триметазидина.
Уровень повреждений ДНК у крыс с АКМП не отличался статистически значимо от показателя для интактных животных. Не выявлено также значимых отличий в оцениваемом показателе для животных, получавших на фоне абстиненции фабомотизол в дозе 15 мг/кг или триметазидин в дозе 20 мг/кг.
Выявлено статистически значимое снижение уровня атипичных ДНК-комет в группе алкоголизированных крыс по сравнению с животными интактного контроля (2,7 против 7,6 %). У животных, получавших фабомотизол, данный показатель оказался статистически значимо выше по сравнению с группой алкоголизированных крыс и не отличался от значения для интактного контроля. Для животных, получавших триметазидин, также выявлено снижение содержания атипичных ДНК-комет по сравнению с интакным контролем, однако различия оказались статистически незначимы.
Таким образом, установлено, что у крыс сформировавшаяся АКМП не сопровождается увеличением уровня повреждений ДНК клеток миокарда. Вместе с тем, в результате исследований выявлен феномен, заключающийся в снижении у алкоголизированных крыс уровня клеток с высокой степенью фрагментации ДНК по сравнению с интактными животными. При этом у животных, получавших на фоне абстиненции фабомотизол, данный показатель оказался на уровне значения интактного контроля.
На сегодняшний день не существует единого мнения о происхождении атипичных ДНК-комет [10]. Считается, что ДНК-кометы с высокой степенью фрагментации ДНК, т. н. «ghost cells» или «hedgehogs» формируют клетки, находящиеся на стадии апоптоза или пред-апоптотической гибели, что подтверждалось данными о корреляционной зависимости уровней таких клеток с показателем апоптоза, оцениваемого классическими методами (TUNEL, FACS) [11]. В то же время такие ДНК-кометы выявляются и для клеток, гибнущих вследствие цитотоксического воздействия [10, 12].
Предполагая возможный вклад процессов клеточной гибели в наблюдаемые эффекты были повторены эксперименты с оценкой повреждений ДНК в нейтральной версии метода ДНК-комет с параллельной оценкой уровней апоптоза. Нейтральная версия метода позволяет оценить исключительно двунитевые разрывы в ДНК, характерные при фрагментации хроматина в ходе реализации программы апоптоза. Полученные данные представлены в табл. 2.
Как и в экспериментах с щелочной версией метода уровень повреждённости ДНК в миокарде крыс с АКМП статистически значимо не отличался от показателя для интактного контроля. При этом у интактных крыс значение повреждённости ДНК, оцениваемое по показателю % ДНК в хвосте, оказалось значимо ниже, по сравнению с аналогичным показателем, получаемым при щелочной версии метода – 12,0 ± 3,9 против 36,9 ± 5,3 %. Полученные данные свидетельствует о том, что повреждения ДНК в миокарде крыс в условиях физиологической нормы представлены в большей степени однонитевыми разрывами и/или щелочно-лабильными сайтами. Не выявлено отличий в оцениваемом показателе для животных, получавших триметазидин (30 мг/кг) и комбинацию фабомотизол (10 мг/кг) + триметазидин (20 мг/кг) на фоне абстиненции.
Выявлено статистически значимое снижение уровня атипичных ДНК-комет в группе крыс с АКМП по сравнению с животными интактного контроля (1,9 против 7,1 %). В группе животных, получавших триметазидин, данный показатель оказался статистически значимо выше по сравнению с группой без введения препарата и не отличался от значения для интактного контроля. Для животных, получавших комбинацию триметазидин + фабомотизол, также наблюдалось повышение процентного содержания атипичных ДНК-комет по сравнению с алкоголизированными животными.
Анализ данных TUNEL показал, что у контрольных животных наблюдается незначительный уровень кардиомиоцитов, находящихся на стадии апоптоза (рис. 2). Индекс апоптоза составил в среднем 0,014, что согласуется с данными литературы [13]. Ни в одной из экспериментальных групп не выявлено значимых отличий по сравнению с контрольной – индекс апоптоза для группы животных с АКМП и животных, получавших фабомотизол составил 0,02 и 0,015, соответственно.
Таким образом, в ходе исследований установлено, что сформировавшаяся АКМП у крыс не сопровождается увеличением уровня повреждений ДНК и апоптотической гибелью кардиомиоцитов. У контрольных животных индекс апоптоза составил 0,014 (1,4 % апоптотических клеток), тогда как в ~8 % кардиомиоцитов наблюдали высокую степень фрагментации ДНК. Настоящие данные позволяют заключить, что выявляемые атипичные ДНК-кометы не могут рассматриваться как апоптотические, и клеточная гибель кардиомиоцитов реализовывается отличным от апоптоза путём.
Согласно современным представлениям, ведущую роль в поддержании тканевого гомеостаза в сердечной мышце играет процесс аутофагии [14]. Нарушение аутофагии установлено при гипертензии, ишемии-реперфузии, инфаркте миокарда, а также при АКМП [14, 15]. Высокая активность аутофагии в сердечной мышце у пациентов с дилатированной кардиомиопатией ассоциировалась с лучшим прогнозом [16]. Индуктор аутофагии рапамицин снижал выраженность экспериментальной АКМП у крыс [17].
Деградация ДНК клеток в процессе аутофагии происходит предположительно при участии фермента ДНКаза II, которая вносит разрывы в ДНК, не детектируемые методом TUNEL [18]. В настоящем исследовании выявлен низкий уровень TUNEL-позитивных кардиомиоцитов, тогда как около 8 % имели фрагментированную ДНК. Вышеописанное позволяет предполагать, что атипичные ДНК-кометы на препаратах миокарда крыс могут формировать клетки, находящиеся на стадии аутофагической деградации хроматина. В пользу этого предположения косвенно свидетельствуют полученные данные о значительном снижении таких ДНК-комет у крыс с АКМП, при которой наблюдается ингибирование аутофагии в ткани миокарда [15]. Ранее было показано, что фабомотизол и триметазидин проявляют кардиопротективное действие, статистически значимо снижая интенсивность дилатационной алкогольной кардиомиопатии [6]. В настоящем исследовании введение на фоне абстиненции фабомотизола и триметазидина per se или в комбинации приводило к увеличению содержания атипичных ДНК-комет в миокарде крыс с АКМП до значений интактного контроля. Это позволяет рассматривать появление кардиомиоцитов с фрагментированной ДНК как важный механизм регуляции и поддержания гомеостаза миокарда. Полученные данные определяют перспективность исследований, направленных на изучение роли и механизмов аутофагии в функционировании миокарда с целью разработки фармакологических мишеней для терапии АКМП и других сердечно-сосудистых патологий.
Заключение
Сформировавшаяся АКМП у крыс не сопровождается увеличением уровня повреждений ДНК и апоптотической гибелью клеток миокарда. У крыс с АКМП выявлено снижение уровня кардиомиоцитов с высокой степенью фрагментации ДНК, детектируемых на препаратах в виде атипичных ДНК-комет и являющихся, предположительно, клетками на стадии аутофагической фрагментации хроматина. Фабомотизол и триметазидин или их комбинации, вводимые животным с АКМП на фоне абстиненции, приводят к восстановлению уровней клеток с фрагментированной ДНК до значений физиологической нормы, что свидетельствует о значимой роли их возникновения в поддержании тканевого гомеостаза миокарда.
Список литературы
1. Ивашкин В.Т., Драпкина О.М., Ашихмин Я.И. Алкогольная кардиомиопатия // Медицинская помощь: Научно-практинеский журнал. - 2006. - №3. - С.11-15. [Ivashkin V.Т., Drapkina O.M., Yashikhmin Y.I. Alcoholic cardio-myopathy. Meditsinskaya pomoshch’: Nauchno-prakticheskii zhurnal. 2006;(3):11-15. (In Russ).]
2. Юсупова А.О. Алкогольная кардиомиопатия: основные аспекты эпидемиологии, патогенеза и лекарственной терапии // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2014. - Т. 10. - №6. - С:651- 658.
3. Крыжановский С.А, Цорин И.Б., Колик Л.Г., и др. Трансляционная модель алкогольной кардиомиопатии // Молекулярная медицина. - 2015. - №3. - С.40- 47
4. Piano MR, Phillips SA. Alcoholic cardiomyopathy: pathophysiologic insights. Cardiovasc. Toxicol. 2014;14(4):291- 308. DOI: 10.1007/s12012-014-9252-4
5. Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Шредер О.В., и др. Генотоксические поражения и болезни // Молекулярная медицина. - 2013. -№3. - С.3-19.
6. Цорин И.Б., Мирошкина И.А., Ионова Е.О., и др. Сравнительное изучение кардиопротекторного действия триметазидина и фабомотизола гидрохлорида у крыс со сформировавшейся алкогольной кардиомиопатией в условиях продолжающегося потребления этанола // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2016. - №3. -С.38-41.
7. Hartmann A., Agurell E., Beevers C., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline comet assay. Mutagenesis. 2003;18(1):45-51.
8. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч.1. Методические рекомендации по оценке ДНК-повреждений методом щелочного гель-электрофореза отдельных клеток в фармакологических исследованиях. - М.: Гриф и К; 2012. - С.115-128. [Guidance on Preclinical Evaluation of Medicines. Part
9. Metodicheskie rekomendatsii po otsenke DNK-povrezhdenii metodom shchelochnogo gel’elektroforeza otdel’nykh kletok v farmakologicheskikh issledovaniyakh. Moscow: Grif i K.; 2012. P. 115-128. (In Russ).]
10. Сапожников А.Г., Доросевич А.Е. Гистологическая и микроскопическая техника: Руководство. - С.: САУ; 2000.
11. Жанатаев А.К., Анисина Е.А., Чайка З.В., и др. Феномен атипичных ДНК-комет // Цитология. - 2017. - Т.59. - №3. - С.163-168.
12. Lorenzo Y., Costa S., Collins AR, et al. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 2013;28(4):427- 432. DOI: 10.1093/mutage/get018
13. Hartmann A., Kiskinis E., Fjollman A., et al. Influence of cytotoxicity and compound precipitation on test results in the alkaline comet assay. Mutat Res. 2001;(497):199- 212.
14. Akiyama K., Gluckman TL, Terhakopian A., et al. Apoptosis in experimental myocardial infarction in situ and in the perfused heart in vitro. Tissue Cell. 1997;(29):733- 743.
15. Wang S., Ren J. Role of autophagy and regulatory mechanisms in alcoholic cardiomyopathy. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2018 Jun;1864(6 Pt A):2003-2009. DOI: 10.1016/j.bbadis.2018.03.016
16. Shimomura H., Terasaki F., Hayashi T., et al. Autophagic degeneration as a possible mechanism of myocardial cell death in dilated cardiomyopathy. Jpn Circ J. 2001;(65):965- 968. DOI: 10.1253/jcj.65.965
17. Saito T., Asai K., Sato S., et al. Autophagic vacuoles in cardiomyocytes of dilated cardiomyopathy with initially decompensated heart failure predict improved prognosis. Autophagy. 2016;12(3):579- 87. DOI: 10.1080/15548627.2016.1145326
18. Tu X., Wang C., Ru X., et al. Therapeutic effects of rapamycin on alcoholic cardiomyopathy. Exp Ther Med. 2017 Oct;14(4):2763- 2770. DOI: 10.3892/etm.2017.4901
19. Fujiwara Y., Wada K., Kabuta T. Lysosomal degradation of intracellular nucleic acids-multiple autophagic pathways. J. Biochem. 2017 Feb 1;161(2):145- 154. DOI: 10.1093/jb/mvw085
Об авторах
Алий Курманович ЖанатаевРоссия
Ирина Александровна Мирошкина
Россия
Иосиф Борисович Цорин
Россия
Злата Владимировна Чайка
Россия
Сергей Александрович Крыжановский
Россия
Андрей Дмитриевич Дурнев
Россия
Рецензия
Для цитирования:
Жанатаев А.К., Мирошкина И.А., Цорин И.Б., Чайка З.В., Крыжановский С.А., Дурнев А.Д. Повреждённость ДНК в клетках миокарда крыс с экспериментальной алкогольной кардиомиопатией: модифицирующие эффекты фабомотизола и триметазидина. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2018;(2):28-35. https://doi.org/ 10.24411/2587-7836-2018-10012.
For citation:
Zhanataev A.K., Miroshkina I.A., Tsorin I.B., Chayka Z.V., Kryzhanovskii S.A., Durnev A.D. Dna damage in myocardial cells of rats with experimental alcoholic cardiomyopathy: modifyng effects of fabomotizole and trimetazidene. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2018;(2):28-35. (In Russ.) https://doi.org/ 10.24411/2587-7836-2018-10012.