Исследование влияния фабомотизола на поведенческие нарушения у потомства крыс, подвергнутых действию табачного дыма и этанола

Введение

В современной литературе неоднократно обращалось внимание на медицинскую значимость сочетания лекарств с алкоголем или табаком [1–4]. Особо значимы исследования последствий их комбинированных воздействий на преи постнатальное развитие потомства [5, 6]. Во-первых, в связи с тем, что от 11 до 36 % женщин не отказываются от курения во время беременности [7, 8], а 35 % – продолжают употреблять спиртные напитки [9]. Во-вторых, по причине широкой распространённости самолечения при высокой заболеваемости лиц, злоупотребляющих алкоголем и табакокурением [10, 11].

В большинстве случаев в фокусе исследований оказываются негативные эффекты подобного рода комбинированных воздействий. Однако представляется, что в ряде случаев непреднамеренные комбинации лекарств с алкоголем или табаком могут иметь позитивные эффекты. В спектре фармакологической активности отечественного анксиолитика фабомотизола (афобазола) выявлены антимутагенные и антитератогенные эффекты [12], что позволяет предполагать его позитивное влияние на развитие потомства, подвергнутого внутриутробному воздействию алкоголя или табачного дыма.

Цель работы

Оценка влияния фабомотизола на физическое развитие и поведение потомства крыс, подвергнутых воздействию этанола или табачного дыма.

Материалы и методы

Исследования проведены на аутбредных беременных крысах, полученных из питомника «Филиал Столбовая» ФГБНУ НЦ биомедицинских технологий. Каждая экспериментальная группа включала не менее 10 особей.

Животных содержали в условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» при свободном доступе к полнорационному комбикорму и профильтрованной водопроводной воде. Основные правила содержания и ухода за животными соответствовали национальному стандарту РФ ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», приказу Минздрава РФ от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» и рекомендациям международных нормативов: Директиве 2010/63 EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях от 22 сентября 2010 года, Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123) (Страсбург, 18 марта 1986 года) и Principles on Good Laboratory Practice (OECD, ENV/ MC/ CUEM (98)17, 1997 и 2011). Все процедуры с животными в исследованиях были рассмотрены и утверждены институтской комиссией по биомедицинской этике на предмет соответствия этическим принципам обращения с животными.

Для получения беременных животных самок крыс во второй половине дня подсаживали к самцам в отдельные клетки по схеме 2 самки – 1 самец. День обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках в ходе микроскопирования при увеличении ×10 принимали за 1-й день беременности.

Этанол (4,3 мл/кг, 40 % об.) вводили перорально с 10-го по 19-й дни беременности [13–15]. Экспозицию табачным дымом от 4 сигарет с фильтром, содержащих 13 мг смол и 1 мг никотина, выполняли на протяжении всей беременности один раз в сутки в течение 20 мин в камерах объёмом 72 дм3 при помощи оригинальной установки (рис. 1) [16, 17]. Уровень воздействий обеспечивал отсутствие эмбриолетальных эффектов.

В качестве фармакологического корректора постнатальных нарушений использовали фабомотизол (2[2(морфолино) этилтио] -5-этоксибензимидазола гидрохлорид) – оригинальный селективный анксиолитик, разработанный в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (Рег. № ЛС-000861 от 03.11.2005). Выбор доз фабомотизола осуществляли в соответствие с данными предыдущих исследований, в частности, по оценке его антимутагенных и антитератогенных свойств [12]. Фармацевтическую субстанцию исследуемого препарата растворяли в воде дистиллированной для получения раствора определённой концентрации. Во всех вариантах экспериментов фабомотизол вводили беременным крысам перорально в дозах 1 и 10 мг/кг. Его давали ежедневно за 10–15 мин до введения этанола с 10-го по 19-й дни беременности или процедуры принудительного содержания в атмосфере табачного дыма на протяжении всей беременности.

При изучении постнатального развития потомства крыс, подвергнутых воздействию алкоголя или табачного дыма, были сформированы следующие группы животных: контрольная (1-я группа), модельная (2-я группа) и две группы пренатальной коррекции (3и 4-я группы). Крысам 2-й группы с 10-го по 19-й дни беременности вводили 40 % об. этанол или с 1-го дня беременности подвергали принудительному содержанию в атмосфере табачного дыма. Животные 3и 4-й групп перед обработкой этанолом или табачным дымом получали фабомотизол в объёме 0,5 мл / 200 г массы тела в дозах 1 и 10 мг/кг, соответственно. Контрольной группе перорально вводили воду дистиллированную в аналогичные сроки в эквивалентном объёме или содержали в камере с продуванием атмосферного воздуха в отсутствие табачного дыма.

У новорождённого потомства на 5-й день жизни оценивали становление безусловных рефлексов и мышечного тонуса. Наличие рефлекса «переворачивания на плоскости» определяли путём помещения каждого крысёнка на спину на плоской поверхности стола и фиксировали в течение 60 секунд возвращение в положение на четырёх лапах. Рефлекс «избегания края» регистрировали при помещении каждого крысёнка на край стола (при этом передние лапы касались края) и считали формирование рефлекса завершённым при отползании от края в течение 10 секунд. Мышечную силу определяли при помощи установки «Горизонтальная верёвочка», состоящей из каната толщиной 2 мм, натянутого и зафиксированного на штативе из поливинилхлорида. Каждого крысёнка поочерёдно подвешивали передними лапами на канат, регистрировали время удерживания на «Горизонтальной верёвочке» и фиксировали число крысят, способных удержаться передними лапами более 3 секунд.

В возрасте 60 дней те же животные были обследованы в тестах «Т-образный лабиринт» и «Экстраполяционное избавление».

«Т-образный лабиринт», состоящий из стартовой камеры (непищевая среда) и боковых рукавов лабиринта (пищевая среда), разделённых перегородкой, использовался для изучения условно-рефлекторной деятельности и оценки когнитивных способностей потомства крыс [18–20]. Пищедобывательный навык вырабатывали в течение 5 последовательных дней. Животные совершали по 5 пробежек в день длительностью 5 мин (300 секунд). Началу эксперимента предшествовала пищевая депривация в течение 24 ч. Когнитивная задача состояла в способности крыс в условиях свободного выбора целенаправленно находить пищевое подкрепление (результат обучения), находящееся в кормушке одного из рукавов лабиринта, в пределах фиксированного времени опыта (скорость достижения цели). Фиксировали время достижения пищевого подкрепления и количество нахождений пищевого подкрепления.

Тестирование в установке «Экстраполяционное избавление» позволяет определить способность животного искать пути преодоления острой стреcс-ситуации и проследить становление когнитивных функций в онтогенезе. Установка состоит из внутреннего цилиндра из прозрачного пластика, вмонтированного во внешнюю ёмкость (бак) с закреплённой на стенке лестницей. Содержимое бака заполняли водой (t = 21 – 23 0С) так, чтобы цилиндр погружался в воду на 2 см. Крыс помещали в цилиндр и наблюдали за их поведением на протяжении 2 мин, регистрируя латентное время до подныривания под край цилиндра и время до нахождения сетки на краю бака (время плавания) [21, 22].

Регистрация и обработка показателей условно-рефлекторной деятельности и обучения в «Т-образном лабиринте» и когнитивной деятельности в установке «Экстраполяционное избавление» проводилась с помощью программного обеспечения RealTimer (процедурный таймер) (ООО НПК «Открытая Наука», Россия).

Статистическая обработка результатов исследования осуществлялась, согласно Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств [23]. Проверку нормальности распределения данных осуществляли с помощью критерия Шапиро–Уилкса. Статистическую оценку по показателям формирования сенсорно-моторных рефлексов и мышечного тонуса крысят контрольных и опытных групп осуществляли с применением расчёта усреднённых значений, абсолютных и относительных частот показателей в модуле «Основные статистики»; достоверность различий оценивали с использованием модуля «Вероятностный калькулятор» и t-критерия Стъюдента.

Для оценки результатов поведенческих исследований, полученных при тестировании в установках «Т-образный лабиринт» и тест «Экстраполяционное избавление», использовали непараметрические методы статистики. Расчёт медианы, нижних и верхних квартилей показателей поведенческого тестирования проводили в модуле «Основные статистики». При определении уровня статистической значимости использовали метод парных сравнений основанный на знаковых рангах Вилкоксона и критерий Манна– Уитни. Различия между группами считали статистически достоверными при уровне значимости р < 0,05.

Результаты

Воздействие этанола или табачного дыма приводило к значимому замедлению формирования сенсорно-двигательных рефлексов и мышечного тонуса у потомства на 5-м дне жизни. Все регистрируемые показатели были снижены в 1,5–2 раза по сравнению с контрольной группой (p < 0,05). У потомства крыс, получавших во время беременности фабомотизол в дозах 1 и 10 мг/ кг, регистрируемые параметры становления рефлексов и мышечной силы не отличались от контрольных значений (табл. 1, 2). Выраженных дозовых зависимостей защитного действия не установлено, но отмечена селективность выраженности эффектов от дозы.

Обследование 60-дневных животных, полученных от крыс после воздействия этанолом, в тесте «Т-образный лабиринт» выявило наличие импульсивных реакций на новизну обстановки, выражающихся хаотичными пробежками по площадке лабиринта, и увеличение времени достижения пищевого подкрепления в 3–4 раза (табл. 3). У пренатально алкоголизированных самок, получавших фабомотизол в дозах 1 и 10 мг/кг в период внутриутробного развития, показатель времени достижения пищевого подкрепления не отличался от контрольных значений на 3-й и 1-й день, соответственно, а у самцов уже на 2-й и 1-й день, соответственно. Характер поведенческих реакций в ответ на незнакомую среду и формирование когнитивной деятельности у животных этих групп не отличались от таковых в контрольной группе.

У 70–80 % животных, внутриутробно подвергнутых воздействию табачным дымом, обнаружена двигательная заторможенность и отказ от обучения по нахождению пищевого подкрепления (табл. 4). Фабомотизол в дозах 1 и 10 мг/кг способствовал адаптации животных в незнакомой обстановке и улучшению когнитивных способностей крыс, что выражалось в снижении времени достижения пищевого подкрепления уже с 1-го дня тестирования независимо от половой принадлежности.

В тесте «Экстраполяционное избавление» количество адекватных решений было, в среднем, в 2 раза, значимо снижено у животных, подвергнутых внутриутробному воздействию этанола или табачного дыма (табл. 5, 6). При использовании фабомотизола в диапазоне доз от 1 до 10 мг/кг наблюдалось увеличение числа крыс, принявших адекватное решение в условиях проведённого теста. Снижение латентного времени подныривания под край цилиндра на фоне введения исследуемого фармакологического корректора в дозах 1 и 10 мг/кг выявлено как у пренатально алкоголизированных крыс обоего пола, так и у экспонированных табачным дымом самок 3-й группы (фабомотизол, 1 мг/кг) и самцов 4-й группы (фабомотизол, 10 мг/кг).

Заключение

Экспериментальные результаты в целом согласуются с многочисленными эпидемиологическими и клиническими наблюдениями, указывающими на негативные влияния курения или потребления алкоголя во время беременности на последующее физическое развитие потомства и его адаптационные, интеллектуальные и когнитивные способности.

Выявленные протекторные эффекты фабомотизола, по всей видимости, обуславливаются цитопротекторными, нейропротекторными и антиоксидантными свойствами, которые были подробно описаны ранее и реализуются через взаимодействие с сигма-1, МТ1 и МТ3 рецепторами [24]. Они проявляются при применении фабомотизола в дозах 1 и 10 мг/кг, что совпадает с диапазоном дозировок, в которых лекарственный препарат проявляет анксиолитическую активность в эксперименте и не сильно отличаются от максимальных дозировок (70 мг/ сут.), рекомендованных в клинике [24, 25].

Таким образом, фабомотизол (афобазол) перспективен для дальнейшего исследования в качестве средства, предупреждающего задержки физического и умственного развития потомства, повергнутого воздействию негативных внешних факторов в период внутриутробного развития.