Содержание возбуждающих и тормозных аминокислот в мозге крыс при литий-пилокарпиновых судорогах и на фоне предварительного введения леветирацетама и нового производного рацетама ГИЖ-290

Введение

Леветирацетам обладает не только уникальным противоэпилептическим эффектом [1], но и специфическим профилем действия на животных моделях [2]. Одной из моделей является т. н. «литий-пилокарпиновая», адекватная для тестирования ПЭП, эффективных по отношению к парциальным и вторично-генерализованным судорогам, блокирующих эпилептогенез, а также проявляющих активность при индуцированном судорогами поведенческом дефиците [3]. В 2016–2017 гг. нами было обнаружено и фармакологически охарактеризовано новое производное рацетама, 2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил) уксусной кислоты (ГИЖ-290), значительно превосходящее леветирацетам не только по специфической противосудорожной активности [4], но и по спектру поведенческой активности [5].

Целью настоящей работы стало сравнение влияний ГИЖ-290 и леветирацетама на содержание тормозных (ГАМК, таурина, глицина) и возбуждающих (глутамата, аспартата) аминокислот в префронтальной коре (ПФК) и гиппокампе мозга у нативных крыс, а также при литий-пилокарпиновых судорогах на фоне предварительного введения обоих веществ.

Материалы и методы

Животные: самцы белых аутбредных крыс (200–250 г) были поставлены из питомника «Столбовая» (Московская обл., РФ) и помещены в условия с контролируемой постоянной температурой и влажностью (40–60 %) воздуха, регулярно сменяемым циклом день–ночь (12 ч–12 ч), доступом к воде и еде ad libitum. Организация экспериментов соответствовала этическим нор- мам, регламентирующим эксперименты на животных (Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях: EST № 123 от 18 марта 1986 г., Страсбург; Об утверждении правил лабораторной практики: приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19 июня 2003 г. М., 2003).

Вещества: пилокарпин, хлорид лития (оба Sigma, St. Louis, МО); леветирацетам (Некст Фарма САС 17, Франция); производное 4-фенил-пирролидона-2 (ГИЖ-290) синтезировано в Отделе химии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова».

Литий-хлорид-пилокарпиновая модель судорог. Эксперименты проводили на аутбредных крысах-самцах массой 220–240 г. Согласно принятому протоколу [1, 6], животным вводили водный раствор хлорида лития – 127 мг/кг (в/б), а через 16 ч – пилокарпин (в/б) в дозе 40 мг/кг. В результате у 97–100 % животных развивается эпилептический статус и гибель. Леветирацетам и ГИЖ-290 вводили внутрибрюшинно за 40 мин до введения пилокарпина.

Животные были случайным образом разделены на 6 групп по 7 особей в каждой. Группа I: контроль (физра- створ); группа II: леветирацетам (600 мг/кг, в/б); группа III: ГИЖ-290 (5 мг/кг, в/б); группа IV: LiCl+пилокарпин и физраствор; группа V: LiCl+пилокарпин и леветирацетам; группа VI: LiCl+пилокарпин и ГИЖ-290. Декапитацию крыс проводили через 40 мин после последних инъекций, фронтальную кору и гиппокампы извлекали на льду, быстро замораживали в жидком азоте и сохраняли в криопробирках при –80 °С для проведения хроматографического анализа.

Хроматография. Определение содержания тормозных (ГАМК, глицин, таурин) и возбуждающих (аспартат, глутамат) нейромедиаторных аминокислот в экстрактах ткани мозга проводили методом ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией, согласно модифицированной методике [7]. Поскольку исследуемые аминокислоты в нативной форме являются очень слабыми хромофорами (не флюоресцируют и не поглощаются в UV области), для устойчивой детекции они были предварительно дериватизированы ортофталевым диальдегидом (ОФА), который обладает флуоресцентными свойствами и, вступая в реакцию с аминокислотой, образует флуоресцирующий комплекс. Для деривации аминокислот к 25 мкл супернатанта добавляли 25 мкл 0,1 М боратного буфера и 10 мкл о-фталальдегид-сульфитного реактива в 0,1 М боратном буфере (рН 9,5). ГАМК, аспартат, глутамат, таурин, глицин в начальной концентрации 0,1 мкМ/мл в 0,1 н НClО4 использовали в качестве стандартной смеси для калибровки.

Через 20 мин после инкубации при комнатной температуре, 20 мкл реакционной смеси наносили на колонку Hypersil ODS 5 mkM, 4,6 × 250. Регистрацию продуктов разделения проводили на флюоресцентном детекторе Agilent 1100, США, при длине волны возбуждения 230 нм и длине волны эмиссии 392 нм. Подвижная фаза для определения нейромедиаторных аминокислот состояла из 0,06 M NaH2PO4 ×H2O, 0,0032 M Na2HPO4, 0,025 mМ ЭДТА, и 1,24 mM CH3OH, pH 5,6. Скорость подвижной фазы составляла 1,5 мл/мин.

Cтaтиcтичecкую oбpaбoтку экcпepимeнтaльных дaнных пpoвoдили c пoмoщью пpoгpaммы Statistica 6.0 с привлечением мeтoдов пapaмeтpичecкoй и нeпapaмeтpичecкoй cтaтиcтики (t-тест Стьюдента, тест Манна–Уитни). Тканевое содержание аминокислот выражали в мкмоль/мг сырой ткани. В таблицах пpeдcтaвлeны cpeдниe знaчeния c учётoм cтaндapтнoй oшибки cpeднeгo (mean ± S.E.M).

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования изучали влияние леветирацетама (ЛВТ, 600 мг/кг, в/б) и ГИЖ-290 (5 мг/кг, в/б) на содержание возбуждающих (глутамата и аспартата) и тормозных (ГАМК, таурина, глицина) в префронтальной коре (ПФК) и гиппокампе нативных крыс (группы II и III). Было показано (табл. 1), что под воздействием ЛВТ в гиппокампе происходит увеличение концентрации глутамата до 9,17 ± 0,66 мкмоль/мг сырой ткани (контроль – 7,5 ± 0,44 мкмоль/мг), глицина до 2,01 ± 0,21 (контроль – 1,42 ± 0,13 мкмоль/мг), а также ГАМК – до 6,57 ± 0,42 мкмоль/мг по сравнению с 5,14 ± ± 0,36 в контроле (для всех р < 0,05).

Напротив, в аналогичных условиях ГИЖ-290 проявлял выраженную тенденцию к снижению уровней этих аминокислот в гиппокампе: 6,14 ± 0,51 мкмоль/мг для глутамата, 1,05 ± 0,07 мкмоль/мг (оба р < 0,1) для глицина и 3,79 ± 0,30 мкмоль/мг для ГАМК (р < 0,05). В образцах ПФК никаких значимых изменений аминокислот не наблюдалось, равно как и в гиппокампах для аспартата и таурина (табл. 1).

Таким образом, значимые изменения в мозге нативных крыс наблюдаются только в гиппокампах, причём под воздействием ЛВТ содержание глутамата, глицина и ГАМК возрастают, соответственно, на 22, 42 и 28 % по сравнению с контролем (p < 0,05), тогда как после введения ГИЖ-290, напротив, происходит уменьшение уровней ГАМК (–26 %; p < 0,05), а также в некоторой степени глутамата и глицина (0,05 < p < 0,10).

На следующем этапе тканевые уровни нейроактивных аминокислот измеряли на пике судорог, вызванных комбинацией литий+пилокарпин. Результаты свидетельствуют, что в фазе, соответствующей максимуму судорожной активности, в группе IV происходит некоторое снижение концентрации аспартата в ПФК (0,05 < p < 0,10) и гиппокампе (–20 %; p < 0,05), а также возрастание уровней глутамата (0,05 < p < 0,10) и глицина (+24 %; p > 0,05) в ПФК (табл. 2).

Предварительное введение ни ЛВТ (группа V), ни ГИЖ-290 (группа VI) не изменяло описанных выше эффектов просудорожной комбинации литий + + пилокарпин. Кроме того, под влиянием обоих веществ обнаруживалось увеличение уровней таурина в ПФК, более выраженное для ГИЖ-290: +21 % по сравнению с группой IV (табл. 2). Таурин относится к нейроактивным аминокислотам тормозного действия, вызывающим гиперполяризацию и ингибицию разряда нейронов. Существует предположение, что таурин защищает нейроны от глутаматной токсичности, снижая внутриклеточное содержание кальция и последующие события для обзора см. [8]. Принято считать, что системное введение пилокарпина вызывает судороги, которые избирательно подавляются с помощью ПЭП, модулирующих ГАМКергическую нейропередачу [9]. Хотя убедительные данные о прямом воздействии ЛВТ на ГАМК-систему пока отсутствуют, но у крыс после введения 375 мг/кг пилокарпина было описано снижение уровня аспартата, возрастание глутамина и ГАМК при неизменности концентрации глицина. Защитное действие леветирацетама (34 мг/кг) выражалось в увеличении аспартата и уменьшении глутамина, ГАМК, а также глицина [10]. В наших экспериментах изменений концентраций этих аминокислот не отмечено ни под воздействием комбинации литий + пилокарпин, ни при предварительном введении обоих веществ, что не позволяет считать изученные показатели нейрохимическими маркерами противосудорожного эффекта ЛВТ и ГИЖ-290. Вместе с тем, разнонаправленность влияний обоих веществ с рацетамовой структурой на уровни глутамата, глицина и ГАМК в гиппокампах нативных крыс (увеличение под влиянием ЛВТ и уменьшение после ГИЖ-290) допускает предположение о различиях механизмов их противосудорожных эффектов.

Выводы

1. Новое производное рацетама, 2-оксо- 4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (ГИЖ-290) в дозе 5,0 мг/кг через 80 мин после в/б введения вызывает в гиппокампах интактных крыс увеличение содержания глутамата, глицина и ГАМК на 22, 42 и 28 %, соответственно. Вещество сравнения леветирацетам (600 мг/кг), напротив, приводит к снижению этих показателей на 18, 26 и 26 %, соответственно.

2. В условиях моделирования судорожного состояния у крыс, вызываемого комбинацией литий + пилокарпин, обнаруживается уменьшение концентрации аспартата в гиппокампе на 19 % и повышение уровня глицина в префронтальной коре мозга на 24 % относительно контроля.

3. Предварительное введение ГИЖ-290 и леветирацетама практически не влияет на указанные показатели, но вызывает рост концентрации аминокислоты таурина в гомогенатах префронтальной коры мозга крыс, более выраженное у ГИЖ-290.

4. Полученные результаты не позволяют рассматривать изученные показатели маркерами противосудорожного действия леветирацетама и ГИЖ-290, но указывают на различия в механизмах формирования их противосудорожного эффекта.