Димерный дипептидный миметик 1-й петли фактора роста нервов ГК-6, активирующий PI3K/AKT и МЕК/MAPK/ERK, вызывает дифференцировку клеток РС12 по нейрональному типу

Введение

Развивающиеся нейроны для своего выживания и дифференцировки нуждаются в нейротрофинах, наиболее изученным из которых является фактор роста нервов (NGF). Известно, что эффекты этого нейротрофина на выживаемость и рост отростков нейронов обусловлены взаимодействием с TrkА рецептором. Связывание с NGF ведёт к димеризации и активации TrkA путём аутофосфорилирования внутриклеточных тирозиновых остатков [13]. Это инициирует запуск сигнального трансдукционного каскада, включающего фосфатидилинозитол-3 киназный (PI3K/AKT) и митоген-активируемый протеинкиназный (МЕК/ MAPK/ERK) пути. Активация PI3K/AKT способствует выживанию нейронов. MEK/MAPK/Erk-киназный путь контролирует в основном деление и дифферен- цировку клеток [10, 12].

В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова была сформулирована гипотеза, что разные функции NGF контролируются взаимодействием разных петель с одним и тем же TrkА-рецептором [7]. В рамках этой гипотезы были получены ГК-2 (гексаметилендиа- мид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина)), димерный дипептидный миметик 4-й петли NGF, и ГК-6 (гексаметилендиамид бис-(N-аминокапроил- глицил-L-лизина)), миметик 1-й петли NGF. Оба миметика активировали TrkA-рецептор, PI3K/AKT, и обладали нейропротекторным эффектом [2]. ГК-6, кроме того, активировал ещё и MEK/MAPK/Erkкиназный путь [1].

Цель исследования

Целью настоящего исследования было показать, что миметик 1-й петли ГК-6, но не миметик 4-й петли NGF ГК-2, обладает дифференцирующей активностью.

Материалы и методы

Все манипуляции с клетками выполнялись в строго стерильных условиях. Клетки культивировали при температуре 37 °С, 5 % СО2 в среде ДМЕМ (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, HyClone, США), содержащей 5 % FBS (фетальной бычьей сыворотки, Gibco, США) для клеток линий НТ-22 и РС12 и 10 % FBS для нейробластомы человека линии SH-SY5Y, 2мМ L-глутамина (ICN Pharmaceuticals, США). Смену культуральной среды производили через 24 ч после рассева и каждые последующие 3 дня. Рассев на культуральные флаконы общей площадью 75 см2 (Corning-Costar, США) осуществляли каждую неделю.

Недифференцированые клетки РС12 рассеивали с плотностью 3,5 тыс на лунку в среде ДМЕМ с 1 % сывороткой FBS. В момент посева в среду культивирования добавляли NGF в качестве положительного контроля в конечной концентрации 100 нг/мл (BD Bioscience, Великобритания), пептиды ГК-2 и ГК-6 в конечных концентрациях 10–5–10–8М. Концентрация NGF (≈10–9 М) используется в экспериментах по вы- явлению нейропротекторной и дифференцирующей активности на клетках РС12 [6] и не является токсичной для клеток [16].

В дальнейшем исследуемые пептиды и NGF вносили в среду каждые 48 ч в течение 6 сут. О степени дифференцировки клеток судили по форме и размерам клеток, количеству и длине отростков. Дифференцированными считались клетки, имевшие отростки размером более, чем величина диаметра тела клетки.

Для окраски клеток РС12 на нейрональный маркер бета-тубулин 3 (Abcam, Великобритания) пептиды вносили по той же схеме. После этого клеточную среду отбирали, клетки промывали 2 раза холодным PBS и фиксировали 4 % формальдегидом в PBS. Окрашивание клеток антителами на бета-тубулин 3 в разведении 1:100 проводили в течение ночи при 4 °С в PBS, содержащем 1 % BSA и 0,1 % Tween. В качестве вторичных использовали антитела козы против иммуноглобулина кролика конъюгированные флуоресцентным красителем DyLight 488 (Abcam, США) в разведении 1:250 в течение 1 ч. Фотографирование клеток проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse TS100-F (Япония) при увеличении µ100.

Результаты и обсуждение

Для определения дифференцирующей активности пептидных миметиков фактора роста нервов использовали клетки феохромоцитомы крысы линии РС12. Известно, что эти клетки содержат TrkА рецепторы и при добавлении NGF дифференцируются по нерональному типу [5].

Дипептидный миметик ГК-2 в отличие от NGF не вызывал дифференцировку клеток линии РС12 ни в одной из исследуемых концентраций от 10–5 до 10–8 М. Внешний вид клеток РС12 после обработки ГК-2 не отличался от контроля, образование отростков не наблюдалось (рис. 1).

В то же время на 6-й день после внесения в среду культивирования ГК-6 в конечной концентрации 10–6 М недифференцированные клетки РС12 образовывали цитоплазматические отростки, величина которых превышала диаметр клетки (см. рис. 1). Для подтверждения дифференцировки клеток РС12 по нейрональному типу было использовано окрашивание на нейрональный маркер бета-тубулин III, поскольку последний экспрессируется в дендритах, аксонах и окончаниях аксонов нейронов исключительно при дифференцировке клеток по нейрональному типу [4, 11].

Как видно на рис. 2, в терминалях дифференцированных клеток РС12 как под действием ГК-6 (10–6 М), так и NGF (≈10–9 М) действительно обнаруживается бета-тубулин III.

Таким образом, дипептидный миметик 1-й петли фактора роста нервов ГК-6 вызывает дифференцировку клеток РС-12 по нейрональному типу. Полученные нами данные об отсутствии дифференцирующего действия у ГК-2, который активирует Akt-путь и не активирует Erk и наличия дифференцирующей активности у ГК-6, который активирует оба сигнальных пути, согласуются с данными литературы [3, 8] о необходимости активации MEK/MAPK/Erkкиназного пути для дифференцировки клеток по нейрональному типу.

Таким образом, выявленная нами способность у исследованных пептидов вызывать дифференцировку (ГК-6) либо отсутствие таковой (ГК-2) свидетельствует в пользу того, что разные петли NGF могут быть ответственны за разные функции этого белка.

При изучении активации TrkA рецептора после внесения ГК-2 и ГК-6 нами были использованы антитела на TrkA, содержащий фосфорилированный тирозин Y490. Было показано, что оба этих дипептида вызывали фосфорилирование TrkA рецептора по этому тирозину. При этом ГК-2 и ГК-6 имели разный паттерн активации пострецепторных сигнальных киназ. Можно предположить, что фосфорилирование других тирозиновых последовательностей вовлечено в активацию разных пострецепторных сигнальных путей под действием димерных миметиков разных петель фактора роста нервов и, в конечном итоге, в дивергенцию функций NGF. Согласно данным литературы, существует несколько тирозиновых остатков, фосфорилирование которых приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей. Три из них, Y670, Y674 и Y675, представлены в активирующей петле киназного домена и регулируют киназную активность рецептора. Фосфорилирование этих остатков необходимо для конформационных изменений, обеспечивающих взаимодействие каталитического центра и С-концевых последовательностей тирозина. Фосфорилирование Y785 связано с активацией фосфолипазы PLС-γ, ответственной за процесс клеточной дифференцировки и активацию Erk1/2 [8]. Мутация хотя бы одного из трёх остатков Y670, Y674 и Y675 активирующей петли полностью предотвращают фосфорилирование Y785 и последующую активацию Erk1/2 и PLС-γ. Фосфорилирование Y499 приводит к активации адапторного белка Shc, фосфорилирование Y760 – к активации PI3 киназы, Y794 – к активации PLС-γµ [15]. Отдельные мутации этих трёх остатков тирозина ингибируют рост нейритов в культуре клеток РС12 [9].

Кроме того, существует также независимый от фосфорилирования остатка 490 путь, приводящий к дифференцировке и повышению выживаемости клеток через другие адаптеры. Например, имеются два дополнительных адаптера, rAPS и SH2-B, фосфорилирующиеся при активации Trk-рецептора. Они могут образовывать гомо- и гетеродимеры и образовывать комплекс с адаптерным белком Grb2, обеспечивающий проведение сигнала через белок SOS к Ras/МАРК/ERk и через комплекс белков Ras/Gab к фосфоинозитол- 3-киназе. Показано, что использование антител к SH2-B препятствует NGF-зависимой выживаемости, активации Erk и аксональному росту симпатических нейронов [14].

Arevalo J. et al. указывают на наличие ещё одного сигнального комплекса, ответственного за селективную активацию Erk-киназ [3]. Этот комплекс образуется после взаимодействия трансмембранных доменов TrkА и ARMS. Тирозин Y1096 ARMS фосфорилируется после связывания нейротрофинов с рецепторами и обеспечивает образование докинг сайтов для CrkL, приводящее к Rap1-зависимой долговременной активации Erk-киназ. Нарушения взаимодействия Trk с ARMS или ARMS с CrkL (белком, содержащим домен SH2 и два домена SH3 (src-гомологичные домены)) с помощью мутаций тирозина Y1096 ARMS существенно снижает пролонгированный нейротрофиновый сигналинг Erk, но не влияет на Ras или Akt активацию [3].

Таким образом, конечный ответ клетки на разные сигналы бывает различным, в зависимости от первого участника проведения сигнала от TrkA-рецептора. Активация под действием ГК-2 или ГК-6 одного или двух сигнальных каскадов, а также наличие или отсутствие дифференцирующего действия может быть связано, в частности, с фосфорилированием тирози- новых остатков, отличных от Y490 и далее различных вариантов образующихся комплексов адаптерных белков, участвующих в трансдукции сигнала, что требует дальнейшего изучения.