Количественное определение циклического гуанозинмонофосфата (ц-ГМФ) в тканях крыс с помощью жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии

Циклический 3′,5′-гуанозинмонофосфат является вторичным внутриклеточным мессенджером, который играет ключевую роль во многих физиологических процессах. Количественное определение уровня ц-ГМФ в тканях лабораторных животных является актуальной задачей экспериментальной фармакологии и физиологии.

Цель — разработка методики количественного определения циклического гуанозинмонофосфата в различных тканях крыс с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

Методы. Выделение ц-ГМФ осуществляли путём гомогенизации биоматериала с деионизированной водой. Экстракцию ц-ГМФ из гомогенатов проводили с помощью метанола, в качестве внутреннего стандарта использовали ацикловир. Детектирование ц-ГМФ и ацикловира осуществляли с помощью масс-спектрометра Sciex QTrap 3200MD, хроматографическое разделение проводили с использованием ВЭЖХ Agilent Technologies 1260 Infinity II. В качестве элюента использовали метанол и деионизированную воду.

Результаты. Детекцию ц-ГМФ осуществляли на основании MRM переходов m/z 346,2/152,1; 346,2/135,1, хроматографическое определение ц-ГМФ проводили в обращённо-фазовом режиме на колонке Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 4,6×100 мм, 2,7 мкм. Время удерживания ц-ГМФ и ацикловира составило 7,85 и 7,45 минут, соответственно, при общей продолжительности хроматографического анализа 12 минут. Аналитический диапазон методики определения ц-ГМФ в гомогенатах составил 0,5–1000,0 пмоль/мл. Для апробации методики был проведён анализ содержания ц-ГМФ в тканях интактных крыс Wistar.

Заключение. Разработанная биоаналитическая ВЭЖХ-МС/МС-методика количественного определения ц-ГМФ полностью соответствует валидационным требованиям. Метрологические характеристики методики позволяют с высокой точностью оценить содержание ц-ГМФ в различных тканях крыс.

1. Кобалава Ж.Д., Лазарев П.В. Значение сигнального пути “оксид азота — растворимая гуанилатциклаза — циклический гуанозинмонофосфат” в патогенезе сердечной недостаточности и поиске новых терапевтических мишеней. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2021;20(6):3035. DOI: 10.15829/1728-8800-2021-3035.

2. Jehle A, Garaschuk O. The Interplay between cGMP and Calcium Signaling in Alzheimer's Disease. Int J Mol Sci. 2022 Jun 24;23(13):7048. DOI: 10.3390/ijms23137048.

3. Gao Y. Biology of vascular smooth muscle: vasoconstriction and dilatation. New York, NY, USA: Springer. 2017;8:105. DOI: 10.1007/978-981-10-4810-4.

4. Lincoln TM. Cyclic GMP and mechanisms of vasodilation. Pharmacol Ther. 1989;41(3):479-502. DOI: 10.1016/0163-7258(89)90127-7.

5. Gambaryan S. The Role of NO/sGC/cGMP/PKG Signaling Pathway in Regulation of Platelet Function. Cells. 2022 Nov 21;11(22):3704. DOI: 10.3390/cells11223704.

6. Li Z, Liang Y, Zhang G, et al. An important stimulatory role for the cGMP-dependent protein kinase ii in platelet activation, in vivo thrombosis and haemostasis. Authorea. 2020. DOI: 10.22541/au.160802063.39198387/v1.

7. Prasad H, Mathew JKK, Visweswariah SS. Receptor Guanylyl Cyclase C and Cyclic GMP in Health and Disease: Perspectives and Therapeutic Opportunities. Front Endocrinol (Lausanne). 2022 Jun 29;13:911459. DOI: 10.3389/fendo.2022.911459.

8. Qin L, Zang M, Xu Y, et al. Chlorogenic Acid Alleviates Hyperglycemia-Induced Cardiac Fibrosis through Activation of the NO/cGMP/PKG Pathway in Cardiac Fibroblasts. Mol Nutr Food Res. 2021 Jan;65(2):e2000810. DOI: 10.1002/mnfr.202000810.

9. Chen Y, Zheng Y, Iyer SR, et al. C53: A novel particulate guanylyl cyclase B receptor activator that has sustained activity in vivo with anti-fibrotic actions in human cardiac and renal fibroblasts. J Mol Cell Cardiol. 2019 May;130:140–150. DOI: 10.1016/j.yjmcc.2019.03.024.

10. Cantó A, Martínez-González J, López-Pedraja R, et al. Effect of nitric oxide inhibitors in retinitis pigmentosa. In Nitric Oxide in Health and Disease. Academic Press. 2023;289–303. DOI: 10.1016/B978-0-443-13342-8.00001-6.

11. Wucherpfennig S, Haq W, Popp V, et al. Using cGMP analogues to modulate photoreceptor light sensitivity: Perspectives for the treatment of retinal degeneration. BioRxiv. 2022;02. DOI: 10.1101/2022.02.07.478618.

12. Rosenbrock H, Giovannini R, Schänzle G, et al. The Novel Phosphodiesterase 9A Inhibitor BI 409306 Increases Cyclic Guanosine Monophosphate Levels in the Brain, Promotes Synaptic Plasticity, and Enhances Memory Function in Rodents. J Pharmacol Exp Ther. 2019 Dec;371(3):633–641. DOI: 10.1124/jpet.119.260059.

13. Sani G, Kotzalidis GD, Fiaschè F, et al. Second messengers and their importance for novel drug treatments of patients with bipolar disorder. Int Rev Psychiatry. 2022 Nov-Dec;34(7-8):736–752. DOI: 10.1080/09540261.2022.2119073.

14. Jehle A, Garaschuk O. The Interplay between cGMP and Calcium Signaling in Alzheimer's Disease. Int J Mol Sci. 2022 Jun 24;23(13):7048. DOI: 10.3390/ijms23137048.

15. Kashgari FK, Ravna A, Sager G, Lyså R, Enyedy I, Dietrichs ES. Identification and experimental confirmation of novel cGMP efflux inhibitors by virtual ligand screening of vardenafil-analogues. Biomed Pharmacother. 2020 Jun;126:110109. DOI: 10.1016/j.biopha.2020.110109. Epub 2020 Mar 28. Erratum in: Biomed Pharmacother. 2022 Aug;152:113228.

16. Li M, Ji Y. Propranolol Inhibits the Growth of Cervical Cancer Cells by Inhibiting Cyclic Guanosine Monophosphate/Protein Kinase G (cGMP/ PKG) Pathway. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 2022; 12(2):422–426. DOI: 10.1166/jbt.2022.2916.

17. Di Iorio P, Ronci M, Giuliani P, et al. Pros and Cons of Pharmacological Manipulation of cGMP-PDEs in the Prevention and Treatment of Breast Cancer. Int J Mol Sci. 2021 Dec 27;23(1):262. DOI: 10.3390/ijms23010262.

18. Wang Z, Ma D, Xi Z. Cyclic dinucleotides: a new–generation drug for immune therapy. Nucleic Acids in Medicinal Chemistry and Chemical Biology: Drug Development and Clinical Applications. 2023;41–83. DOI: 10.1002/9781119692799.ch2.

19. Tan J, Wu B, Chen T, et al. Synthesis and Pharmacological Evaluation of Tetrahydro-γ-carboline Derivatives as Potent Anti-inflammatory Agents Targeting Cyclic GMP-AMP Synthase. J Med Chem. 2021 Jun 10;64(11):7667–7690. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c00398.

20. Fakhri S, Ahmadpour Y, Rezaei H, et al. The antinociceptive mechanisms of melatonin: role of L-arginine/nitric oxide/cyclic GMP/ KATP channel signaling pathway. Behav Pharmacol. 2020 Dec;31(8):728–737. DOI: 10.1097/FBP.0000000000000579.

21. Baena V, Owen CM, Uliasz TF, et al. Cellular Heterogeneity of the Luteinizing Hormone Receptor and Its Significance for Cyclic GMP Signaling in Mouse Preovulatory Follicles. Endocrinology. 2020 Jul 1;161(7):bqaa074. DOI: 10.1210/endocr/bqaa074.

22. Vente JD, Garssen J, Tilders FJ, et al. Single cell quantitative immunocytochemistry of cyclic GMP in the superior cervical ganglion of the rat. Brain Res. 1987 May 12;411(1):120–128. DOI: 10.1016/0006-8993(87)90688-3.

23. Yamamoto I, Tsuji J, Takai T, Fujimoto M. Double antibody enzyme immunoassay for the quantitation of adenosine 3', 5' -cyclic monophosphate (cyclic AMP) and guanosine 3', 5'-cyclic monophosphate (cyclic GMP) in tissue and plasma. J Immunoassay. 1982;3(2):173–196. DOI: 10.1080/15321818208056994.

24. Van Damme T, Zhang Y, Lynen F, Sandra P. Determination of cyclic guanosine- and cyclic adenosine monophosphate (cGMP and cAMP) in human plasma and animal tissues by solid phase extraction on silica and liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012 Nov 15;909:14–21. DOI: 10.1016/j.jchromb.2012.10.002.

25. Martens-Lobenhoffer J, Dautz C, Bode-Böger SM. Improved method for the determination of cyclic guanosine monophosphate (cGMP) in human plasma by LC-MS/MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2010 Feb 1;878(3-4):487–491. DOI: 10.1016/j.jchromb.2009.12.009.

26. Lorenzetti R, Lilla S, Donato JL, de Nucci G. Simultaneous quantification of GMP, AMP, cyclic GMP and cyclic AMP by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 Nov 1;859(1):37–41. DOI: 10.1016/j.jchromb.2007.09.008.

27. Minkler PE, Stoll MS, Ingalls ST, et al. Quantification of carnitine and acylcarnitines in biological matrices by HPLC electrospray ionizationmass spectrometry. Clin Chem. 2008 Sep;54(9):1451–1462. DOI: 10.1373/clinchem.2007.099226.

28. Kinscherf DA, Chang MM, Rubin EH, et al. Comparison of the effects of depolarizing agents and neurotransmitters on regional CNS cyclic GMP levels in various animals. J Neurochem. 1976 Mar;26(3):527–530. DOI: 10.1111/j.1471-4159.1976.tb01506.x.

29. Veerappan R, Malarvili T. Chrysin Pretreatment Improves Angiotensin System, cGMP Concentration in L-NAME Induced Hypertensive Rats. Indian J Clin Biochem. 2019 Jul;34(3):288–295. DOI: 10.1007/s12291-018-0761-y.

30. Bojunga J, Dresar-Mayert B, Usadel KH, et al. Antioxidative treatment reverses imbalances of nitric oxide synthase isoform expression and attenuates tissue-cGMP activation in diabetic rats. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Apr 9;316(3):771–780. DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.02.110.