Количественное определение моноаминовых нейротрансмиттеров в гомогенатах головного мозга крыс с помощью ВЭЖХ-МС/МС

Актуальность. Оценка влияния лекарственных средств на нейромедиаторные процессы является важной составляющей фармакодинамических исследований. Количественное определение моноаминовых нейротрансмиттеров в структурах головного мозга лабораторных животных является актуальной задачей фармакологии и физиологии.

Цель – разработка методики количественного определения серотонина, дофамина, норэпинефрина, гистамина и эпинефрина в гомогенатах головного мозга крыс с помощью ВЭЖХ-МС/МС.

Методы. Выделение нейромедиаторов из мозга крыс осуществляли путём гомогенизации биоматериала с ацетонитрилом и хлористоводородной кислотой. Очистку извлечения проводили с помощью жидкость-жидкостной экстракции с хлороформом и изопропанолом. Детектирование моноаминов осуществляли с помощью масс-спектрометра AB Sciex QTrap 3200MD, хроматографирование проводили с использованием ВЭЖХ Agilent Technologies 1260 Infinity II. В качестве элюента использовали метанол и деионизированную воду.

Результаты. Пробоподготовка представляла собой центрифугирование полученного гомогената, высушивание супернатанта в токе азота, растворение осадка в подвижной фазе, очистку раствора с помощью смеси хлороформа и изопропанола. Для хроматографического разделения моноаминовых нейромедиаторов использовали аналитическую колонку Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 4,6 × 100 мм, 2,7 мкм. Общее время хроматографического анализа составило 12 минут, время удерживания норэпинефрина, эпинефрина, дофамина, серотонина, гистамина составило 2,8; 3,2; 5,4; 7,9; и 2,2 минут, соответственно. Аналитический диапазон методики составил 25,0–5000,0 нг/г для эпинефрина, гистамина и дофамина; 5,0–5000,0 нг/г для серотонина и 50,0–5000,0 для норэпинефрина. Для апробации методики был проведён анализ моноаминовых нейромедиаторов в стриатуме интактных крыс Wistar. Заключение. Разработанная биоаналитическая ВЭЖХ-МС/МС-методика количественного определения моноаминовых нейромедиаторов в головном мозге крыс полностью соответствует валидационным требованиям. Метрологические характеристики методики позволяют с высокой точностью оценить содержание норэпинефрина, эпинефрина, дофамина, серотонина и гистамина в структурах головного мозга крыс.

1. Barandouzi ZA, Lee J, del Carmen Rosas M, et al. Associations of neurotransmitters and the gut microbiome with emotional distress in mixed type of irritable bowel syndrome. Sci Rep. 2022;12(1):1648. DOI: 10.1038/s41598-022-05756-0.

2. Федеральный закон Российской Федерации № 61 от 12 апреля 2010 г. «Об обращении лекарственных средств».

3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К; 2012. 17–24 с.

4. Fei YY, Johnson PA, Omran NAL, et al. Maladaptive or misunderstood? Dopamine fasting as a potential intervention for behavioral addiction. Lifestyle Med. 2021;3(1):e54. DOI: 10.1002/lim2.54.

5. Jung-Klawitter S, Kuseyri Hübschmann O. Analysis of catecholamines and Pterins in inborn errors of monoamine neurotransmitter metabolism—from past to future. Cells. 2019;8(8):867. DOI: 10.3390/cells8080867.

6. Kontur PJ, Fechter LD. Brain regional manganese levels and monoamine metabolism in manganese-treated neonatal rats. Neurotoxicol Teratol. 1988;10(4):295–303. DOI: 10.1016/0892-0362(88)90031-1.

7. Seyfried CA, Adam G, Greve T. An automated direct-injection HPLCmethod for the electrochemical/fluorimetric quantitation of monoamines and related compounds optimized for the screening of large numbers of animals. Biomed Chromatogr. 1986;1(2):78–88. DOI: 10.1002/bmc.1130010206.

8. Wang W, Wu X, Yang CS, et al. An unrecognized fundamental relationship between neurotransmitters: Glutamate protects against catecholamine oxidation. Antioxidants (Basel). 2021;10(10):1564. DOI: 10.3390/antiox10101564.

9. Cannazza G, Carrozzo MM, Cazzato AS, et al. Simultaneous measurement of adenosine, dopamine, acetylcholine and 5-hydroxytryptamine in cerebral mice microdialysis samples by LC–ESI-MS/MS. J Pharm Biome Anal. 2012;71:183–186. DOI: 10.1016/j.jpba.2012.08.004.

10. Greco S, Danysz W, Zivkovic A, et al. Microdialysate analysis of monoamine neurotransmitters—a versatile and sensitive LC–MS/MS method. Anal Chim Acta. 2013;771:65–72. DOI: 10.1016/j.aca.2013.02.004.

11. Uutela P, Reinilä R, Piepponen P, et al. Analysis of acetylcholine and choline in microdialysis samples by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2005;19(20):2950–2956. DOI: 10.1002/rcm.2160.

12. Xu N, Qiu C, Wang W, et al. HPLC/MS/MS for quantification of two types of neurotransmitters in rat brain and application: Myocardial ischemia and protection of Sheng-Mai-san. J Pharm Biomed Anal. 2011;55(1):101–108. DOI: 10.1016/j.jpba.2010.12.015.

13. Kovac A, Somikova Z, Zilka N, et al. Liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for determination of panel of neurotransmitters in cerebrospinal fluid from the rat model for tauopathy. Talanta. 2014;119:284–290. DOI: 10.1016/j.talanta.2013.10.027.

14. Syslová K, Rambousek L, Kuzma M, et al. Monitoring of dopamine and its metabolites in brain microdialysates: Method combining freeze-drying with liquid chromatography–tandem mass spectrometry. J Chromatogr A. 2011;1218(21):3382–3391. DOI: 10.1016/j.chroma.2011.02.006.

15. Chen D, Zhang J-X, Cui W-Q, et al. A simultaneous extraction/derivatization strategy coupled with liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the determination of free catecholamines in biological fluids. J Chromatogr A. 2021;1654:462474. DOI: 10.1016/j.chroma.2021.462474.

16. Thomas J, Khanam R, Vohora D. A validated HPLC-UV method and optimization of sample preparation technique for norepinephrine and serotonin in mouse brain. Pharm Biol. 2015;53(10):1539–1544. DOI: 10.3109/13880209.2014.991837.

17. Ma S-R, Yu J-B, Fu J, et al. Determination and application of nineteen monoamines in the gut microbiota targeting phenylalanine, tryptophan, and glutamic acid metabolic pathways. Molecules. 2021;26(5):1377. DOI: 10.3390/molecules26051377.

18. Xie Z, Lorkiewicz P, Riggs DW, et al. Comprehensive, robust, and sensitive UPLC-MS/MS analysis of free biogenic monoamines and their metabolites in urine. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2018;1099:83–91. DOI: 10.1016/j.jchromb.2018.09.012.

19. Minkler P, Stoll M, Ingalls S et al. Quantification of Carnitine and Acylcarnitines in Biological Matrices by HPLC Electrospray Ionization–Mass Spectrometry. Clin Chem. 2008;54(9):1451–1462. DOI:10.1373/clinchem.2007.099226.

20. González-Pardo H, Arias J, Gómez-Lázaro E, et al. Sex-Specific Effects of Early Life Stress on Brain Mitochondrial Function, Monoamine Levels and Neuroinflammation. Brain Sci. 2020;10(7):447. DOI: 10.3390/brainsci10070447.

21. Doroshenko Y, Lelevich V. Biogenic Monoamines, Their Precursors, and Metabolites in the Brain of Rats under Experimental Circulatory Failure. Neurochemical Journal. 2020;14(3):295–302. DOI: 10.1134/S1819712420030034.

22. Mahmood D, Akhtar M, Jahan K, et al. Histamine H3 receptor antagonists display antischizophrenic activities in rats treated with MK-801. J Basic Clin Physiol Pharmacol. 2016;27(5):463–471. DOI: 10.1515/jbcpp-2015-0045.

23. Krupina N, Khlebnikova N, Narkevich V, et al. The Levels of Monoamines and Their Metabolites in the Brain Structures of Rats Subjected to Two- and Three-Month-Long Social Isolation. Bull Exp Biol Med. 2020;168(5):605–609. DOI: 10.1007/s10517-020-04761-5.