Разработка подходов для исследования биораспределения бицистронной терапевтической плазмидной конструкции в организме мыши

Актуальность. Применение генотерапевтических препаратов для лечения генетических заболеваний и стимуляции процессов регенерации является длительным и подразумевает осуществление повторных инъекций, что может привести к усилению диссеминации генотерапевтических конструкций из области введения и нежелательной эктопической экспрессии закодированных в них ростовых факторов. Существующие подходы по изучению фармакокинетики лекарственного препарата для оценки диссеминации генотерапевтического препарата из очага введения неприменимы. Цель: оценить пригодность метода ПЦР в реальном времени для изучения биораспределения перспективного генотерапевтического препарата в организме мыши при курсовом применении. Методы. Самцам мышей F1 CBA×C57/Black делали инъекции исследуемой плазмиды в денервированную большеберцовую мышцу после травмы нерва, а также через 4, 9 и 13 дней в дозировке 60 и 120 мкг/мышь. Через 7, 14 и 28 дней после окончания курса инъекций образцы органов и тканей изымали, тотальную ДНК выделяли, и содержание плазмидной ДНК оценивали с помощью ПЦР в реальном времени. Результаты. Было показано, что изученная генетическая конструкция способна диссеминировать из области введения. Было установлено, что пик диссеминации для данной конструкции в органах и тканях мыши достигается через 14–28 суток после окончания курсового применения, при этом эктопической экспрессии факторов роста в них не наблюдается. Заключение. Предложенный метод является специфичным, высокочувствительным и линеен в широком диапазоне концентраций. Таким образом, он может быть рекомендован для изучения биораспределения потенциальных генотерапевтических препаратов в организме экспериментальных животных в рамках комплекса доклинических исследований.

1. Одинак М.М., Живолупов С.А. Заболевания и травмы периферической нервной системы. Санкт-Петербург: Издательство «СпецЛит»; 2009.

2. Шевелев И.Н. Травматические поражения плечевого сплетения. – М.: Издательство «Москва»; 2005.

3. Karagyaur M, Rostovtseva A, Semina E, Klimovich P et al. A bicistronic plasmid encoding brain-derived neurotrophic factor and urokinase plasminogen activatorstimulates peripheral nerve regeneration after injury. J Pharmacol Exp Ther. 2020;372(3):248–255. DOI: 10.1124/jpet.119.261594.

4. Boyd JG, Gordon T. Neurotrophic factors and their receptors in axonal regeneration and functional recovery after peripheral nerve injury. Mol Neurobiol. 2003;27(3):277–324. DOI: 10.1385/MN:27:3:277.

5. Frostick SP, Yin Q, Kemp GJ. Schwann cells, neurotrophic factors, and peripheral nerve regeneration. Microsurgery. 1998;18(7):397–405. DOI: 10.1002/(sici)1098-2752(1998)18:7<397::aid-micr2>3.0.co;2-f.

6. Huang Q, Wei H, Wu Z, et al. Preferentially Expressed Antigen of Melanoma Prevents Lung Cancer Metastasis. PLoS One. 2016;11(7):e0149640. DOI: 10.1371/journal.pone.0149640.

7. Maripuu A, Björkman A, Björkman-Burtscher IM, Mannfolk P et al. Reconstruction of sciatic nerve after traumatic injury in humans - factors influencing outcome as related to neurobiological knowledge from animal research. J Brachial Plex Peripher Nerve Inj. 2012 Oct 10;7(1):7. DOI: 10.1186/1749-7221-7-7.

8. EMEA. Guideline on bioanalytical method validation. 2011.

9. US FDA. Guidance for industry: Q2B validation of analytical procedures: methodology. Rockville. MD: Nov 1996.

10. OECD. Guidance document on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. 2005.

11. Schechtman LM. Internationally harmonized processes for test method evaluation. Validation and regulatory acceptance: The role of OECD guidance document 34. Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments, 14, Special Issue. Рр. 475–782 (2008).

12. Хамиде З. Сеньюва, Гилберт Д. Простое руководство для пользователей по разработке и валидации методов / Перевод на русский язык под ред. А. Галкин. – М.: Издательство «ООО Ториус 77»; 2011.

13. Ermer J, Nethercote PW. Method Validation in Pharmaceutical Analysis. Wiley, 2014.