Разработка и валидация методики количественного определения метотрексата в транспортной среде методом ВЭЖХ-МC/МС

Актуальность. BCRP – эффлюксный белок-транспортёр, играющий важную роль в фармакокинетике широкого спектра лекарственных веществ. Активность BCRP в опытах in vitro оценивается по транспорту субстратов белка-транспортёра (метотрексата и др.) через билипидную мембрану клеток, гиперэкспрессирующих BCRP, например, клетках линии Caco-2. Цель: разработать и валидировать методику количественного определения субстрата BCRP – метотрексата в транспортной среде клеток линии Caco-2 методом ВЭЖХ-МС/МС. Методы исследования. Работа выполнена на ВЭЖХ-хроматографе «Ultimate 3000» («ThermoFisher», США) с тандемным масс-селективным детектором TSQ Fortis («ThermoFisher», США). Условия хроматографического анализа были следующими: колонка UCT Selectra C18 4,6 mm ×100 mm 5um, 100A, предколонка Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-5UM, температура разделения – 35 °С, скорость потока – 0,3 мл/мин, объём вводимой пробы – 2 мкл, время анализа – 10 мин. Использовали градиентный режим элюирования: соотношение раствора 0,1 % муравьиной кислоты и ацетонитрила составило на 0 мин 75 и 25 %; 0,4 мин – 60 и 40 %; 6 мин – 20 и 80 %; 8 мин – 75 и 25 %. В данных условиях время удерживания метотрексата – 3,11 мин. Условия детектирования: метотрексат – положительный режим ионизации, 455,15 m/z → 308,125 m/z, энергия столкновения – 22,99 В, фрагментация источника – 5, давление CID-газа – 2 мТорр. Извлечение метотрексата из транспортной среды (раствор Хэнкса с 25 мМ Хепес и 1 % диметилсульфоксида) после инкубирования с клетками линии Сaco-2 в течение 3 ч осуществляли смесью метанол+вода в соотношении 1:1. Результаты. Разработанная методика была валидирована по следующим параметрам: селективность, линейность, точность, прецизионность, предел количественного определения, перенос пробы, стабильность образцов. Подтверждённый аналитический диапазон методики составил 60–10 000 нмоль/л в транспортной среде. Выводы: разработана и валидирована методика количественного определения метотрексата в транспортной среде клеток линии Caco-2 методом ВЭЖХ-МС/МС.

1. Doyle LA, Yang W, Abruzzo LV, Krogmann T, Gao Y, Rishi AK, Ross DD. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95(26):15665–15670. DOI: 10.1073/pnas.95.26.15665.

2. Maliepaard M, Scheffer GL, Faneyte IF et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 2001;61(8):3458–3464.

3. Scheffer GL, Scheper RJ. Drug resistance molecules: lessons from oncology. Novartis Found Symp. 2002;243:19-31.

4. Chen ZS, Robey RW, Belinsky MG et al. Transport of methotrexate, methotrexate polyglutamates, and 17beta-estradiol 17-(beta-D-glucuronide) by ABCG2: effects of acquired mutations at R482 on methotrexate transport. Cancer Res. 2003;63(14):4048–4054.

5. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Guidance for Industry Drug Interaction Studies – Study Design, Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Recommendations, 2012, 75 P.

6. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). In Vitro Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and TransporterMediated Drug Interactions Guidance for Industry, 2020, 43 P.

7. Изучение биоэквивалентности воспроизведенных лекарственных средств. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. – М.: Гриф и К; 2013. – 328 с. [Izuchenie bioekvivalentnosti vosproizvedennykh lekarstvennykh sredstv. Rukovodstvo po ekspertize lekarstvennykh sredstv. Tom I. Moscow: Grif i K; 2013. (In Russ).].

8. Руководства по экспертизе лекарственных средств Том I, правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза, Совет Евразийской экономической комисси, решение от 3 ноября 2016 №85. [Rukovodstva po ekspertize lekarstvennykh sredstv Tom I, pravil provedeniya issledovanii bioekvivalentnosti lekarstvennykh preparatov v ramkakh Evraziiskogo ekonomicheskogo soyuza, Sovet Evraziiskoi ekonomicheskoi komissi, reshenie ot 3 noyabrya 2016 №85. (In Russ).]

9. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). Bioanalytical method validation. U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2018, 41 P.

10. ЕМА Guideline on bioanalytical method validation. European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use: London, 2011, 23 P.