Исследование стереоспецифичности нейропротекторного действия дипептидного миметика мозгового нейротрофического фактора ГСБ-106 на модели оксидативного стресса в культуре гиппокампальных клеток линии НТ-22

Введение 

Мозговой нейротрофический фактор (BDNF) относится к семейству нейротрофинов, которое включает в себя фактор роста нервов, нейротрофин-3 и нейротрофин-4/5. Благодаря своей способности увеличивать выживаемость нейронов, нейротрофины рассматриваются как эндогенные нейропротекторы. BDNF особенно привлекателен в этом отношении, так как он улучшает выживание и предупреждает дегенерацию популяций нейронов, вовлечённых в такие заболевания, как болезнь Альцгеймера (базальные холинергичекие нейроны переднего мозга), Паркинсона (дофаминергические нейроны черной субстанции), Хантингтона [1, 2]. Особый интерес к BDNF определяется его участием в патогенезе депрессий [3].

Однако применение BDNF при системном введении ограничено такими факторами, как биодеградация, низкая способность проникать через гематоэнцефалический барьер и наличием нежелательных побочных эффектов [4, 5].

Ранее в ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» был получен димерный дипептидный миметик 4-й петли BDNF — FCB-106LL (гексаметилендиамид бис-моносукцинил-L-серил-L-лизина) на основе гипотезы о том, что фармакофорными участками нейротрофинов являются бета-изгибы их шпилькообразных петель [6].

ГСБ-106, аналогично BDNF, проявлял нейропротекторную активность на модели оксидативного стресса в культуре гиппокампальных нейронов линии НТ-22 в интервале концентраций 10-5—10-8 М [7].

С целью развития новой группы нейропротекторов на основе димерных дипептидных миметиков BDNF в настоящей работе исследована связь структуры и активности в ряду аналогов ГСБ-106. Для этого были синтезированы два новых диастереомера ГСБ-106 — FT-106DL (замена L-Ser на D-Ser) и ГТ-106LD (замена L-Lys на D-Lys), и изучена их нейропротекторная активность in vitro. 

Материалы и методы

Культура гиппокампальных клеток линии НТ-22 

Иммортализованные клетки гиппокампа мыши линии НТ-22 рассеивали на 96-луночные планшеты, обработанные поли-Д-лизином (BD Biosciences, San Jose, USA; 5 мкг/см2), с плотностью 3,5 тыс. на лунку в среде ДМЕМ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки (Gibco Life Technologies, New York, USA) и 2 мМ Z-глутамина (ICN, Eschwege, Germany), и инкубировали при 37 °С в атмосфере 5% СО2.

Модель оксидативного стресса 

Оксидативный стресс моделировали путём внесения в клеточную среду культивирования раствора перекиси водорода (Н2О2) в конечной концентрации 1,5 мМ. Клетки с H2O2 инкубировали в атмосфере 5% СО2 при 37 °С 30 мин. Далее среду заменяли на нормальную и через 4 ч определяли жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5 дифенилтетразолия (МТТ) (Sigma, США)) [8]. В качестве положительного контроля использовали BDNF (BD Bioscience, Великобритания) в конечной концентрации 50 нг/мл. Fr-106DL и Fr-106LD вносили в конечных концентрациях 10-5—10-8М за 24 ч до повреждения клеток и после отмывки Н2О2. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре “Multiscan EX” (Thermo, США) при длине волны 600 нм.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом по Данну (ANOVA). Данные представлены в виде m ± s.d.

Результаты и их обсуждение

Для выявления нейропротекторного действия димерных дипептидных стереоизомеров ГСБ-106 была использована модель окисидативного стресса. Оксидативный стресс является одним из центральных звеньев нейродегенеративных процессов. Индукция этого стресса в культуре клеток является одной из самых популярных моделей для исследования повреждений нейронов при ишемии и других нейродегенеративных заболеваний. Последовательность событий, происходящих при этом в клетке, достаточно хорошо изучена. Поэтому эта модель особенно интересна с точки зрения исследования действия новых потенциальных нейропротекторов.

Полученные результаты показывают, что внесение перекиси водорода приводило к достоверному снижению жизнеспособности клеток НТ-22. BDNF защищал клетки от гибели в обеих схемах эксперимента. Frr-106DL и FX-106LD не оказывали нейропротекторного действия ни в одной из исследуемых концентраций как при внесении в культуру гиппокампальных нейронов линии НТ-22 за 24 ч до оксидативного стресса (рис. 1), так и после повреждения перекисью водорода (рис. 2).

Таким образом, показано исчезновение нейропротекторного эффекта при замене остатка L-серина на D-серин (ГТ-106DL), а также при замене L-лизина на D-лизин (FF-106LD). Полученные результаты свидетельствуют о ключевой роли L-конфигурации как для остатка лизина, так и для остатка серина, в проявлении нейропротекторной активности стереоизомеров ГСБ-106.