Доклиническое изучение фармакокинетики нового анксиолитика дипетидной структуры ГБ-115

Введение

При создании новых лекарственных средств необходимым этапом является изучение их фармакокинетики на доклиническом уровне. Результаты доклинического изучения дают возможность оценить скорость и степень всасывания лекарственных соединений из места введения, проницаемости через гистогематические барьеры и доставки их к месту действия, тканевой биодоступности, их биотрансформации с выявлением основных «мажорных» метаболитов, а также активных метаболитов, обладающих такой же или иной фармакологической активностью и выведения из организма лекарственного вещества, и продуктов его превращения. Кроме того, эти исследования позволяют установить взаимосвязь между фармакокинетикой и фармакодинамикой изучаемых лекарственных веществ, что в дальнейшем может играть важную роль при переносе данных с животных на человека, выбора оптимального пути введения лекарственного вещества с учётом его метаболизма в результате «первого прохождения» через печень, а также его биологической доступности. Особо значимым и в практическом отношении являются исследования фармакокинетики различных лекарственных форм изучаемых препаратов и выбор на этой основе оптимальных, обладающих большей биодоступностью, позволяющих рекомендовать их для дальнейшего изучения и внедрения в медицинскую практику.

В ФБГНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» создан новый дипептидный ретроаналог холецистокинина — ГБ-115 (амид N-фенил-гексаноил-глицил-L-триптофана), обладающий анксиолитической, антиалкогольной, антидепрессивной и анальгетической активностью [1].

Целью работы являлось изучение экспериментальной фармакокинетики и биодоступности субстанции ГБ-115 и четырёх его фармацевтических композиций для перорального применения, отличающихся по технологии приготовления и составу вспомогательных веществ, а также выбор оптимальной лекарственной формы с большей скоростью и степенью всасывания.

Экспериментальная часть

Материалы и методы исследования. В качестве стандартных веществ была использована фармацевтическая субстанция ГБ-115, содержание основного вещества в которой было не ниже 99%.

В работе использовались кристаллическая и микронизированная субстанции ГБ-115, а также 4-х лабораторных образца фармацевтических композиций ГБ-115, предоставленные опытно-технологическим отделом ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова», отличающихся по составу и технологии приготовления:

1. фармацевтическая композиция №1: Субстанция ГБ-115, неусиллин, лудипресс;
2. фармацевтическая композиция №2: Микронизированная субстанция ГБ-115, твёрдая дисперсная система с поливинилпирролидоном;
3. фармацевтическая композиция №3: Микронизированная субстанция ГБ-115, неусиллин, лудипресс;
4. фармацевтическая композиция №4: Микронизированная субстанция ГБ-115, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза.

Экспериментальные животные. Фармакокинетику ГБ-115 изучали после перорального введения кристаллической и микронизированной субстанций и фармацевтических композиций в виде водной суспензии белым беспородным крысам самцам (массой 180220 г), полученных из питомника «Столбовая». Животных содержали в стандартных условиях вивария при 12 часовом световом режиме и свободном доступе к корму и воде. Исследования проводили на здоровых, бодрствующих животных. До проведения исследования животные находились в течение 12 ч на водной диете.

Масс-спектрометрический анализ соединения ГБ-115 в плазме крови крыс. Анализ биологических проб ГБ-115 проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором для точной идентификации структуры пептида. Разделение проводили с помощью хроматографа Agilent 1200 Series LCMSD TRAP (Agilent Technologies, Palo Alto, США) с автоматическим вводом проб, детектора Agilent 6300 series iontrap (США) и компьютера с соответствующим пакетом для обсчёта хроматограмм. Мобильная фаза состояла из 1 л водного раствора с добавлением 50 мл 0.1 М раствора аммония ацетата и 5 мл муравьиной кислоты (А) и 100% ацетонитрила (В). ВЭЖХ анализ проводился в режиме градиентного элюирования: 0 мин — 5% (В), 5 мин — 60% (В), 7 мин — 80% (В), 12 мин — 80% (В), 15 мин — 10% (В). Скорость потока подвижной фазы составляла 0,25 мл/мин. Температура колонки составила 30°С. Объём вкола: 1 мкл.

Масс-спектры были получены с использованием ионизации электрораспылением (ИЭР) и регистрацией как положительных, так и отрицательных ионов. В результате позитивной ионизации образуется ряд положительных ионов с m/z 473, 457, 435, 418, которые предположительно соответствуют катионированным молекулярным ионам [М+K]+, [М+Na]+, [MH]+ и [MHNH3]+ соответственно. Наличие большого количества пиков затрудняет количественное определение анализируемого вещества. Поэтому была выбрана негативная ионизация, посредством которой образуется один отрицательный ион с m/z=434, который в дальнейшем подвергается фрагментации с образованием ионов с массовыми числами — 286 и 304, что предположительно соответствует следующим фрагментам: ацетат глицил-L-триптофана и гидроксилированный ацетат глицил-L-триптофана, соответственно.

В качестве распыляющего газа использовали азот со скоростью — 9 л/мин.

Методика количественного определения соединения ГБ-115 в плазме крови крыс с применением метода высокоэффективной хроматографии с УФ-детектором.

Разделение проводили на жидкостном хроматографе, состоящем из изократической помпы SYSTEM COLD 127 (США), ультрафиолетового детектора и компьютера с соответствующим пакетом программ для обсчёта хроматограмм «Амперсенд» (Россия).

Хроматографическое разделение проводили на аналитической колонке — Luna 5μ C 18(2), 250×4,6 мм, детектирование проводили при длине волны 282 нм, что позволило избежать влияния коэкстрактивных веществ, которые мешали бы определению ГБ-115. При использовании диапазона длин волн 200230 нм наблюдается совпадение максимумов поглощения ГБ-115 и примесей, что и обусловило выбор максимума поглощения в УФ-свете при длине волны 282 нм.

Подвижная фаза — ацетонитрил:вода (400:450), трифторуксусная кислота. Скорость потока подвижной фазы — 1,0 мл/мин. pH раствора составлял 3,2.

Хроматографический анализ проводили при комнатной температуре (2224°С). Перед хроматографированием подвижную фазу дегазировали на ультразвуковой бане. Пробу вводили при помощи микрошприца в петлю хроматографа объёмом 100 мкл.

Обработка биологических проб, экстракция ГБ-115 из биологических образцов. Подготовка плазмы крови крыс к хроматографическому анализу. Экстракцию ГБ-115 из биологических образцов проводили следующим образом: к 1 мл плазмы крови, содержащей ГБ-115, добавляли двукратный объём ацетонитрила для осаждения белков. Водно-ацетонитрильный раствор центрифугировали при Т 2°С со скоростью 4000 об/мин в течение 10 мин. Далее отбирали очищенную от белков плазму, добавляли 5 мл эфира, встряхивали в течение 15 мин, отделяли эфирный слой и высушивали в токе азота досуха, остаток растворяли в элюенте и вводили в систему ВЭЖХУФ.

Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации экспериментальных данных. Основные фармакокинетические параметры рассчитаны модельно-независимым методом (программа «MIND») [3]:

AUC0→∞ (нг/мл×мин) — площадь под кривой «концентрация лекарственного вещества — время», рассчитывается от момента введения до бесконечности;

AUC0→t (нг/мл×мин) — площадь под фармакокинетической кривой, рассчитывается от момента введения до момента последней регистрации концентрации исследуемого соединения;

С (нг/мл) — концентрация препарата в плазме крови после перорального введения;

Tmax (мин) — время достижения максимальной концентрации препарата в плазме крови после перорального введения;

Cmax (нг/мл) — максимальная концентрация лекарственного вещества в плазме крови после перорального введения;

Cmax/AUC  (мин1)  —  параметр,  характеризующий скорость всасывания препарата в системный кровоток; MRT (мин) — среднее время пребывания лекарственного вещества в организме;

Kэл (мин1) — константа скорости элиминации, параметр, характеризующий скорость выведения препарата из организма;

T1/2 (мин) — период, за который выводится половина введённой и всосавшейся дозы лекарственного вещества;

Vzpo, (л) — гипотетический объём распределения;

F (%) — относительная биодоступность: (AUC0→t(A)/ AUC0→t (B) × 100%).

Статистическая обработка полученных результатов. Полученные экспериментальные данные были обработаны с помощью программы «Excel v.11.0». Достоверность различий для сравниваемых концентраций исследуемых соединений оценивали с помощью критерия Стьюдента [4].

Поскольку представленные фармакокинетические кривые были построены по усреднённым значениям 58 полученных данных на каждую временную точку, то при расчётах фармакокинетических параметров отсутствует статистическая обработка результатов. На всех графиках представлены средние значения Хср±SD (SD — стандартное отклонение).

Результаты исследований и их обсуждение

Фармакокинетика ГБ-115 у крыс после перорального введения кристаллической и микронизированной субстанции в дозе 100 мг/кг. Фармакокинетические кривые ГБ-115 после перорального введения крысам микронизированной и кристаллической субстанций в дозе 100 мг/кг представлены на рис. 1. Время регистрации ГБ-115 в плазме крови крыс колеблется от 45 до 60 мин для кристаллической и микронизированной субстанций, соответственно. Максимумы концентраций ГБ-115 наблюдаются через 10 мин после введения кристаллической и через 20 мин после введения микронизированной субстанции. Исходя из данных рис. 5, можно сделать вывод, что после введения кристаллической субстанции, регистрируются более высокие концентрации ГБ-115 в течение первых 15 мин, но в последующие интервалы времени концентрации соединения снижаются и их значения становятся ниже, чем концентрации после введения микронизированной субстанции.

Кроме того, можно отметить, что после перорального введения ГБ-115 как в виде микронизированной, так и кристаллической субстанций неизменённое соединение быстро всасывается и поступает в системный кровоток, и уже через 5 мин в плазме крови крыс регистрируются значительные концентрации анализируемого вещества.

Средние концентрации ГБ-115 в различные интервалы времени и его фармакокинетические параметры после введения кристаллической и микронизированной субстанций вещества представлены в табл. 1 и 2, соответственно.

Как видно из приведённых выше таблиц, время достижения максимальной концентрации ГБ-115 после введения кристаллической субстанции в дозе 100 мг/кг в плазме крови крыс составило 10 мин, а её вели чина — 146,16 нг/мл. Максимальная же концентрация ГБ-115послевведениямикронизированнойсубстанции в той же дозе составила 113,02 нг/мл, и достигалась через 20 мин.                                                                                                   

Анализ параметров кинетики позволяет заключить, что ГБ-115 быстро выводится из организма после перорального введения микронизированной и в большей степени кристаллической субстанций, на что указывают значения констант скорости элиминации из плазмы крови (Кet), которые составили 0,0323 и 0,0471 мин^-1 соответственно. Быстрое выведение ГБ-115 из плазмы крови животных также характеризуется такими фармакокинетическими параметрами, как среднее время удерживания препарата в организме, которое почти в 2 раза выше для ГБ-115 после введения микронизированной субстанции 39,87 мин, чем после введения кристаллической — 23,83 мин. Соответственно это нашло отражение и для периода полувыведения, значения которого ниже для кристаллической субстанции — 14,73 мин, чем для микронизированной субстанции — 21,49 мин.

Подводя итоги, следует отметить, что ГБ-115 в 1,5 раза более продолжительное время находится в организме испытуемых животных после его введения в виде микронизированной субстанции, чем при введении в той же дозе кристаллической субстанции. На это также указывают полученные значения плазменного клиренса ГБ-115 (4,013 л/мин для микронизированной и 6,099 л/мин для кристаллической субстанции). Значения гипотетического объёма распределения ГБ-115 после введения анализируемых субстанций незначительно отличается, что указывает на сходный характер распределения активного вещества в органах и тканях. Скорость всасывания и площадь под фармакокинетической кривой ГБ-115 существенно отличается после введения крысам двух субстанций. Так, площадь под фармакокинетической кривой ГБ-115 после введения микронизированной субстанции в 1,5 раза выше, чем после введения кристаллической, что свидетельствует о более высокой относительной биодоступности ГБ-115 после введения микронизированной субстанции. Однако, скорость всасывания ГБ-115 после введения микронизированной субстанции, судя по времени достижения Сmax, происходит медленнее, чем после введения кристаллической субстанции, что может рассматриваться как преимущество данного технологического приёма — микронизации и более продолжительно определяться в плазме крови животных после введения микронизированной субстанции. Это может сопровождаться более продолжительным фармакологическим действием вещества. Надо отметить, что микронизация, которая   должна способствовать увеличению скорости всасывания, не всегда увеличивает скорость растворения и абсорбцию лекарственного вещества, в частности, вследствие плохой смачиваемости труднорастворимых веществ. Важно учитывать и то, что появление на измельченном материале электростатического заряда приводит к его комкованию, потере сыпучести, плохой смачиваемости. Одной из причин отсутствия желаемого эффекта (увеличение скорости растворения и абсорбции) от изучаемого технологического приёма микронизации является наличие процессов агломерации и агрегации. При микронизации происходит резкое увеличение удельной поверхности частиц и вместе с тем усиление притяжения Вандер-Ваальсовых сил между неполярными молекулами, что и лежит в основе процессов агломерации и агрегации.                                                                      

Возможно, вследствие одной из приведённых причин, ГБ-115 более медленно всасывается в организме подопытных животных после введения микронизированной субстанции и неизменное соединение регистрируется в плазме крови животных более продолжительное время. С целью проверки фармакокинетических закономерностей ГБ-115, полученных после перорального введения крысам различных субстанций изучаемого соединения, в опытно-технологическом отделе ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» были созданы 4 лабораторных образца фармацевтических композиций ГБ-115 с использованием кристаллической и микронизированной субстанций, а также различных вспомогательных веществ. Результаты проведённых исследований фармакокинетики и биодоступности четырёх фармацевтических композиций изучаемого соединения представлены на рис. 2 и в табл. 3. 

На рис. 2 представлены фармакокинетические кривые ГБ-115 в плазме крови крыс после однократного перорального введения ГБ-115 в виде водного раствора кристаллической и микронизированной субстанции, а также его четырёх фармацевтических композиций в дозе 100 мг/кг. Как видно из рис. 2 ГБ-115 быстро всасывается в ЖКТ, поступает в системный кровоток и определяется в плазме крови крыс уже через 5 мин после введения как субстанций, так и 4х фармацевтических композиций. Однако на стадии абсорбции препарата отмечаются значительные различия как в количественном содержании ГБ-115, так и в динамике изменения его концентраций после введения анализируемых фармацевтических композиций.  Для фармацевтической композиции №1 характерно постепенное увеличение концентрации активного соединения с достижением максимальной концентрации через 20 мин после введения, которая составляет 126,25 нг/мл. Фармацевтическая композиция №2 отличается резким подъёмом концентрации фармакологически активного соединения: уже через 5 мин после введения она составляет 103,41 нг/мл и достигает максимума через 15 мин — 185,10 нг/мл. В последующие интервалы времени концентрация ГБ-115 постепенно снижалась на протяжении 1,5 ч и в конечный период времени составила — 35,61 нг/мл. Максимальная концентрация ГБ-115 после введения фармацевтической композиция №3 была самой низкой и составила 97,36 нг/мл через 20 мин после введения. Для данной фармацевтической композиции характерно наличие достаточно высоких концентраций в последующие интервалы времени. Концентрация ГБ-115 после введения фармацевтической композиции №4 достигает своего максимального значения через 15 мин и составляет 121,5 нг/мл.

Значительные различия в кинетике ГБ-115 наблюдались и на стадии его элиминации из плазмы крови крыс. Так, для фармацевтической композиции №1 отмечалось быстрое снижение концентрации ГБ-115 в период 2030 мин и через 45 мин активное вещество в плазме крови крыс не обнаруживалось. Для фармацевтической композиции №2 и №4 концентрация ГБ-115 в плазме крови крыс снижалось более медленно и через 90 мин соединение регистрировалось в достаточно высоком количестве. Характер элиминации ГБ-115 после перорального введения фармацевтической композиции №3 более медленный, причём, высокая его концентрация сохранялась в течение 60 мин и составила в этот интервал времени 66,35 нг/мл.

На основании полученных экспериментальных данных рассчитаны основные фармакокинетические параметры ГБ-115, которые представлены в сводной табл. 3.

Для сравнения длительности пребывания активного вещества в неизменном виде в организме испытуемых животных после введения каждой из предложенных фармацевтических   композиций   необходимо   сравнить следующие параметры: K_el, T1/2, MRT, Cmax/AUC. ГБ-115 быстрее выводится из организма после введения фармацевтической композиции №1. Для неё характерны высокое значение константы скорости элиминации — 0,1475 мин1, короткий период полувыведения — 4,7 мин и небольшое среднее время удержания лекарственного вещества в плазме крови крыс — 18,26 мин. Фармацевтическая  композиция  №3  (Kel      —  0,0323  мин1, T1/2 — 74,01 мин, MRT — 113,20 мин), отличается от фармацевтической композиции №1 более медленным выведением  неизменённого  вещества  в  течение  60 мин, что является хорошим показателем для фармацевтических композиций, содержащих пептидные соединения. Однако величина Cmax у неё самая низкая и к 90 мин после введения концентрация активного вещества ГБ-115 стремится к нулю. Кроме того, для фармацевтической композиции №2 в отличие от других регистрируется 2ой максимум концентраций вещества (между 40 и 60 мин после введения), что может быть связано с эффектом энтерогепатической рециркуляции.

Оптимальные фармакокинетические характеристики получены для фармацевтических композиций №2 и №4: для них характерны более медленное снижение концентраций вещества в плазме крови крыс с Кel — 0.0155 мин-1 и   0,0109 мин-1, невысокие значения клиренса Clpo 1,923 мл/мин и 1,585 мл/мин, длительные периоды полувыведения — 44,75 мин и 63,86 мин и значительные показатели среднего времени удержания ГБ-115 в плазме крови крыс — MRT — 68,32 мин и 95,75 мин, соответственно. Кроме того, для фармацевтических композиций №2 и №3, а также для фармацевтической композиции №4 характерны высокие значения гипотетического объёма распределения — 178,50 мл, 124,20 мл и 146,00 мл, соответственно, что значительно выше объёма распределения фармацевтической композиции №1 — 58,15 мл. После введения животным фармацевтических композиций №2 и №4 определяются самые высокие площади под фармакокинетической кривой ГБ-115 (табл. 3) и, соответственно, самые высокие величины относительной биодоступности, составляющие 192,36% и 190,68% соответственно, что указывает на их преимущество посравнению с другими исследуемыми фармацевтическими композициями. При анализе скорости всасывания (Cmax/AUC) существенных различий для фармацевтических композиций №2 и №4 не обнаружено.

Заключение                                                       

При разработке любого оригинального лекарственного средства важным и необходимым являются фармакокинетические и биофармацевтические исследования. Они, помимо расчёта основных фармакокинетических характеристик вещества, позволяют определить перспективность того или иного пути его введения, а также выбрать оптимальную лекарственную форму изучаемого фармакологического соединения. Для соединения ГБ-115 эти исследования показали возможность использования перорального пути его введения для дальнейшего использования и внедрения его в медицинскую практику. При этом, проанализировав различные субстанции ГБ-115, были найдены существенные отличия их фармакокинетических характеристик и получено значительное преимущество микронизированной субстанции, относительная биодоступность которой превышала таковую для кристаллической субстанции в 1,5 раза. Это послужило основанием для рекомендации этой субстанции при изготовлении различных фармацевтических композиций ГБ-115 для перорального применения.  Фармакокинетическое и биофармацевтическое изучение различных фармацевтических композиций показало, что фармацевтические композиции №2 и №4, изготовленные с применением микронизированной субстанции ГБ-115 и вспомогательных веществ, имели преимущество перед другими представленными на анализ фармацевтическими композициями. Во-первых, они определялись более продолжительное время в плазме крови крыс, а вовторых, была достигнута высокая относительная биодоступность, что позволило выделить эти две фармацевтические композиции и рекомендовать их для дальнейшего фармакологического изучения. Фармацевтическая композиция №2 отличалась самой высокой максимальной концентрацией. В её состав вошли следующие вспомогательные вещества: микронизированная субстанция ГБ-115, твёрдая дисперсная система с поливинилпирролидоном. Такие положительные фармакокинетические характеристики были связаны, с одной стороны, с микронизацией, с другой, с положительным влиянием матрицы поливинилпирролидона, на основе которой была создана фармацевтическая композиция №2. Многочисленными исследованиями доказано, что скорость и продолжительность действия лекарственного вещества в качестве моносоставляющего, диспергированного в матрице поливинилпирролидона, может быть повышена в 23 раза [58].

Фармацевтическая композиция №4 (в её состав входят микронизированная субстанция ГБ-115, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза) характеризовалась   самой высокой площадью под фармакокинетической кривой, ввиду того, что концентрации сохранялись на высоком уровне в течение всего периода наблюдения. Это можно объяснить присутствием в фармацевтической композиции №4 вспомогательного вещества гидроксипропилметилцеллюлозы — гидрофильной матрицы с контролируемой доставкой активного вещества, которая существенно повышает продолжительность высвобождения действующего вещества, что может в значительной степени пролонгировать фармакологический эффект лекарственного препарата [9, 10].                                                        

Поэтому эти две фармацевтические композиции рекомендованы для дальнейшего проведения фармакологических исследований.

Основные выводы                                                       

1. Разработаны высокочувствительные методики качественного (на основе хроматомасс-спектрометрии) и количественного (на основе ВЭЖХ) определения ГБ-115 в биоматериале.
2. Методика экстракции и количественного определения ГБ-115 в биоматериале, основанная на ВЭЖХ с УФ-детектором, обладала высокой чувствительностью и селективностью и была адаптирована для изучения фармакокинетики ГБ-115 у крыс.
3. Сравнительное изучение фармакокинетики и относительной биодоступности кристаллической и микронизированной субстанции ГБ-115 у крыс показало преимущество микронизированной субстанции и перспективность создания на её основе пероральной лекарственной формы.
4. Показано, что из всех вспомогательных веществ, используемых при приготовления фармацевтических композиций ГБ-115, поливинилпирролидон в форме твёрдой дисперсной системы и гидроксипропилметилцеллюлоза оказывают существенное влияние на скорость и степень всасывания изучаемого соединения у крыс.
5. Изучение фармакокинетических характеристик ГБ-115 после перорального введения крысам его четырёх разработанных фармацевтических композиций, отличающихся как по составу, так и по технологии приготовления позволили выявить две оптимальные фармацевтические композиции и рекомендовать их для дальнейшего фармакологического изучения.