Изучение фармакокинетики трёх лекарственных форм препарата для регенеративной генной терапии повреждений поверхностных тканей человека различной этиологии

Введение

Исследование фармакокинетических свойств новых лекарственных веществ является одним из важнейших этапов доклинических испытаний. Изучение фармакокинетики и фармакодинамики лекарственных препаратов позволяют проанализировать процессы всасывания, метаболизма, распределения и выведения исследуемых лекарственных веществ. Анализ процессов распределения позволяет детектировать органы и ткани, в которые они проникают наиболее интенсивно и/или в которых удерживаются наиболее длительно, что может способствовать более детальному изучению механизмов действия лекарственных веществ [1].

Работа посвящена исследованию фармакокинетических свойств лекарственного препарата для регенеративной генной терапии повреждений поверхностных тканей человека различной этиологии (механические, химические, термические травмы, местные радиационные и электрические повреждения и т.п.). Актуальность проекта связана с ростом травматизма, смертностии возрастающей инвалидизацией от травм в Российской Федерации в условиях неблагоприятной экологической обстановки, снижающей регенераторные способности организма человека [2].

В связи с этим неотъемлемым направлением решения данной проблемы является разработка новых медицинских технологий для лечения травматических повреждений. Одним из ключевых элементов системы медицинской помощи при травмах является стимуляция процессов регенерации. Процессы регенерации являются одним из важнейших механизмов поддержания гомеостаза организма, особенно при повреждениях различной этиологии. К ним можно отнести травмы механические, включая операционные, химические, термические, радиационные, ишемические и др. Регенерация поврежденных тканей зависит, в основном, от пролиферации в зоне поражения клеток различных типов и синтеза клетками как собственных элементов, так и компонентов межклеточного вещества.

Лечение ран с использованием данного препарата превосходит известные способы лечения ран, основанные на стимуляции регенераторных процессов. Лечение заболеваний, требующих стимуляции регенераторных процессов, включая повреждения тканей человека различной этиологии, с помощью фармацевтической композиции или препарата для генной терапии на основе синтетического модифицированного гена инсулиноподобного фактора роста человека первого типа является эффективным и обладает существенным преимуществом, так как позволяет снизить дозы инъекционных препаратов и частоту их введения [3].

Целью данного исследования явилось изучение распределения в организме и тканевой биодоступности нового лекарственного препарата на основе плазмидной ДНК pCIGF для регенеративной генной терапии повреждений поверхностных тканей человека различной этиологии. Доклиническое исследование фармакологических свойств илекарственнойбезопасностипрепаратапроведено на мышах, которым препарат вводился однократно и двукратно. Введение жидкой и лиофилизованной форм препарата проводили внутримышечно, гелевая форма применялась наружно. Анализировали различные органы: мозг, сердце, кровь (лейкоцитарную массу и сыворотку), легкое, печень, почку, селезенку, мышцу (место укола) на наличие в них плазмиды в зависимости от времени после введения.

Материалы и методы

Получение плазмидной ДНК pCIGF и исследование фармакокинетических свойств трех лекарстенных форм препарата осуществлялось в несколько этапов:

1. Наработка очищенного препарата плазмидной ДНК

Музейная культура штамма Escherichiacoli/pCIGF представляет собой ночную бульонную культуру, полученную трансформацией штамма E.colliDH10B/R (GIBCO, США) рекомбинантной плазмидной ДНК pCIGF и выращенную из отдельной колонии на среде Луриа-Бертани (LB) с добавлением ампициллина до конечной концентрации 100 мкг/мл. Культивирование вели при температуре 37°С, частоте вращения мешалки от 50 до 250 об/мин, обеспечивающей насыщение культуры кислородом не менее 30%, до достижения оптической плотности 20 - 40 ед, после чего осуществляли сепарирование биомассы, которая и являлась биологической субстанцией для выделения препарата pCIGF.

Очистку препаратов плазмидной ДНК проводили по методу, предложенному Horn с соавторами [4]. Затем применяли только реактивы фармакопейной чистоты (pharmaceutical), и свободную от ЛПС деионизированную воду, проводили работу в стерильных условиях. ДНК растворяли в буфере для хроматографии, которая проводилась на оборудовании ÄKTApurifier (AmershamPharmaciaBiotech, Sweden) при скорости протока жидкости 0,75 мл/мин. Фракции, содержащие не менее 50% суперскрученной формы плазмидной ДНК, объединяли. ДНК осаждали этанолом и повторно наносили на колонку SR 50/100 (AmershamPhаrmaciaBiotech, Sweden), наполненную SephacrylS-1000. Объединяли фракции, содержащие не меньше 90% суперскрученной формы плазмиды. ДНК осаждали этанолом и ресуспендировали в физиологическом растворе хлорида натрия.

Для оценки препарата pCIGF использовали анализ изменения оптической плотности (А) в диапазоне длин волн 200-300 нм. Для этого проводили серию измерений оптических плотностей с шагом 10 нм. Далее строили график зависимости оптической плотности от длины волны. При этом соотношения А_260нм/А_280нм и А_260нм/А_230нм характеризовали чистоту плазмидной ДНК и, соответственно, были не меньше 1,8 – 1,75.

Для определения концентрации плазмидной ДНК в препарате использовали спектрофотометрический метод. Для этого проводили измерение оптической плотности исследуемого образца в стандартной кювете из кварцевого стекла шириной 1 см на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия) при длине волны 260 нм. Концентрацию плазмидной ДНК определяли по формуле:

[ДНК] = А₂₆₀N 50 [мкг/мл], где:

А₂₆₀ – оптическая плотность исследуемого образца при длине волны 260 нм,

N – разведение исходного образца.

Конечная концентрация плазмидной ДНК в препарате должна составлять 1 мг/мл. Контроль структуры плазмидной ДНК оценивали при помощи электрофореза. При этом содержание суперскрученной формы плазмиды было не менее 95% в препарате, а присутствие РНК не детектировалось. Контроль идеинтичности целевого гена проводили секвенированием.Всего было получено 10 мг плазмидной ДНКpCIGF. Концентрированный препарат pCIGF хранили при 4°С в защищенном от света месте. Полученная партия плазмиды использовалась для изготовления иньекционной, лиофильно высушенной и гелевой форм препарата. Для длительного хранения было заложено при температурах -20⁰ , +4⁰ , +20⁰ , +37⁰ по одной серии каждой лекарственной формы.

2. Изучение фармакокинетики гелевой лекарственной формы препарата

Было изучено распределение плазмидной ДНК pCIGFв организме мыши при наружном применении (в случае с гелевой формой препарата) и при однократном и двукратном введении. Введение жидкой и лиофилизованной (разведена физиологическим раствором) форм препарата проводили внутримышечно (100мкг/100мкл плазмиды в физиологическом растворе на мышь). Анализировали различные органы: кожу, мозг, сердце, кровь (лейкоцитарную массу и сыворотку), легкое, печень, почку, селезенку, мышцу  на наличие в них плазмиды в зависимости от времени после введения. Тотальную ДНК выделяли обработкой ткани протеиназой К и депротеинизацией фенолом/хлороформом. Наличие плазмидной ДНК тестировали ПЦР с последующим электрофорезом результатов ОТ и ПЦР в 1 % агарозном геле.

Результаты

1. Изучение фармакокинетики гелевой лекарственной формы препарата

Было изучено распределение плазмидной ДНК pCIGF в организме мыши при наружном применении. Анализировали различные органы: кожу, мозг, сердце, кровь (лейкоцитарную массу и сыворотку), легкое, печень, почку, селезенку, мышцу  на наличие в них плазмиды в зависимости от времени после введения.

Сводные данные по фармакокинетике препарата плазмиды pCIGF в форме геля (примерное содержание в анализируемых образцах) представлены в таблице 1.

Таблица 1. Приблизительная оценка количества плазмидной ДНК pCIGF в различных органах после введения гелевой формы препарата

Как видно из представленных результатов, плазмида pCIGF сразу после нанесения на кожу присутствует в мышце. Наибольшее количество плазмидной ДНК наблюдается в мышце сразу после нанесения геля, затем это количество постепенно уменьшается. В крови (клетки) сигнал появляется через 6 ч после нанесения препарата и увеличивается через сутки, держится в течение 7 суток, затем уменьшается. В крови (сыворотка) слабый сигнал детекктируется через 7 суток после введения. В сердце небольшое количество плазмиды обнаруживается через 6 ч после нанесения гелевой формы препарата и сохраняется еще в течение 2 суток. В легких плазмида детектируется  через 6 ч после нанесения препарата и сохраняется в течение суток. В почках небольшое количество плазмидной ДНК обнаруживается через 6 ч после нанесения препарата и немного увеличивается через сутки, держится до 2 суток.

В мозге, селезенке, печени и хвосте плазмида не детектируется. Через 8 недель количество плазмиды во всех органах мыши становится ниже уровня детекции.

2. Исследование фармакокинетики препарата в жидкой форме и в лиофилизированной форме

Было изучено распределение плазмидной ДНК pCIGFв организме мыши, при однократном и двукратном введении. Введение жидкой и лиофилизованной (разведена физиологическим раствором) форм препарата проводили внутримышечно (100мкг/100мкл плазмиды в физиологическом растворе на мышь). Анализировали различные органы: мозг, сердце, кровь (лейкоцитарную массу и сыворотку), легкое, печень, почку, селезенку, мышцу (место укола) на наличие в них плазмиды в зависимости от времени после введения.

Электрофореграммы ПЦР-анализа образцов ДНК на наличие в них примеси плазмиды представлены на рисунке1. Каждая реакция включала в себя отрицательный контроль - отсутствие ДНК (чаще всего вода) и положительный контроль, представляющий собой известные разведения плазмидной ДНК в 1 мкг геномной ДНК контрольной мыши. Сводные данные примерного количества плазмиды pCIGF в анализируемых образцах представлены в таблицах 2 и 3.

Рис. 1. Электрофореграммы ПЦР-анализа образцов ДНК из тканей различных органов на наличие в них примеси плазмидной ДНК pCIGF (выявление специфического для pCIGF фрагмента ДНК) при разовом и при повторном введении разведенной лиофилизованной формы препарата.

А – мышцы, Б - кровь (клетки), В - кровь (сыворотка), Г – мозг, Д – селезёнка, Е – печень, М – маркер  GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas): снизу-вверх 500 п.о., 750 п.о., 1000 п.о., К- - отрицательный контроль (вода), 1-4 - плазмидная ДНК pCIGF в разном количестве (1 – 0,01 пг, 2 – 0,1 пг, 3 – 1 пг, 4 – 10 пг), (5, 6) - Количество плазмидной ДНК (пг/мкг геномной ДНК) при разовом введении: 5 – через 1 сутки, 6 - через 7 суток, (7, 8) - Количество плазмидной ДНК (пг/мкг геномной ДНК) при повторном введении: 7 - через 1 сутки, 8 - через 7 суток.

Таблица 2. Приблизительная оценка количества плазмидной ДНК pCIGF в различных органах после введения жидкой формы препарата

Таблица 3. Приблизительная оценка количества плазмидной ДНК pCIGF в различных органах при разовом и повторном введении разведенной лиофилизованной формы препарата

Как видно из представленных результатов, плазмида pCIGF сразу после инъекции присутствует во всех анализированных органах, кроме печени и хвоста. Также плазмида не идентифицируется сразу после введения в клетках крови. Наибольшее количество плазмидной ДНК наблюдается в мышце сразу после инъекции, через 6 ч это количество немного уменьшается, на седьмые сутки становится ниже предела чувствительности метода. В легком сигнал пропадает на вторые сутки, в почке – на седьмые. В сыворотке крови слабый сигнал появляется на седьмые сутки после введения. В мозге, селезенке и печени наличие плазмиды наблюдается в течение недели. Через 8 недель количество плазмиды в органах становится ниже уровня детекции.

По данным, представленным в таблице 3, видно, что в случае повторного введения жидкой и лиофилизованной форм препарата количество ДНК pCIGF в первые сутки превышает (кровь (клетки), мозг, печень) количество ДНК при разовом введении или сравнимо с ним (мышцы, селезенка, кровь (сыворотка)). Однако, через 7 суток после повторного введения препарата во всех органах, кроме мозга, наблюдается большее количество плазмидной ДНК, чем при разовом введении.

Обсуждение

Фармакокинетика исследуемого препарата отличается при использовании разных лекарственных форм. Так, например, при нанесении гелевой ДНКpCIGF обнаруживается сразу после нанесения на кожу в мышце, где и локализуется максимальное количество нанесенного вещества. В клетках крови ДНК pCIGF детектируется через 6 ч после нанесения препарата и увеличивается через сутки, держится в течение 7 суток, затем уменьшается, тогда как в сыворотке слабый сигнал детектируется только спустя 7 суток после введения. В целом лишь в некоторых органах с обильным кровоснабжением детектируется небольшое количество плазмиды (сердце, легкие, почки), которое сохраняется в среднем не дольше 2-х суток. В мозге, селезенке, печени и хвосте плазмида не детектируется. Через 8 недель количество плазмиды во всех органах мыши становится ниже уровня детекции.

Фармакокинетика жидкой и лиофилизованной форм препарата такова, что ДНК pCIGFсразу после инъекции присутствует во всех анализированных органах, кроме печени и хвоста, однако наибольшее количество плазмидной ДНК также наблюдается в основном в мышце. Стоит отметить, что в мозге, селезенке и печени наличие плазмиды наблюдается в течение недели. Через 8 недель количество плазмиды в органах становится ниже уровня детекции.

Таким образом, можно заключить, что использование гелевой лекарственной формы препарата является более эффективным, так как оказывает в основном локальное действие на прилегающие к раневой поверхности клетки соединительной ткани. Однако, применение разведенного лиофилизированного препарата в виде инъекций имеет преимущество в том, что препарат может храниться более длительное время, сохраняя при этом стабильность структуры ДНК pCIGF и биологическую активность.