Изучение фармакодинамики наноразмерной формы феназепама на основе поли (бутил) цианоакрилатных наночастиц

Введение

Феназепам – отечественный анксиолитик из группы производных бензодиазепина, широко применяющийся в лечебной практике как анксиолитическое, седативное, снотворное и противосудорожное средство уже более 25 лет. Вместе с тем наличие побочных эффектов, выражающихся в ухудшении моторных и мнестических функций, риске возникновения лекарственной зависимости и синдрома отмены, существенно лимитирует применение феназепама в клинической и, особенно, амбулаторной практике. Уменьшить или устранить побочные эффекты феназепама представляется возможным при создании его наноразмерной формы на основе полимерных наночастиц из поли(бутил)цианоакрилата. К настоящему времени можно считать доказанным, что при включении лекарственных веществ (ЛВ) в наночастицы существенно меняется профиль распределения ЛВ, повышается эффективность и продолжительность действия, а также снижаются побочные эффекты и токсичность [1-8].

Экспериментальная часть 

Получение поли(бутил)цианоакрилатных наночастиц (ПБЦА НЧ) с феназепамом и определение их физико-химических характеристик

В исследовании использовали мономер бутилцианоакрилата (Sicomet 6000, Sichel-Werke, Hannover, Germany). Наночастицы получали методом кислотной полимеризации в среде, содержащей в качестве стабилизатора декстран (мм 70 кДа) в 0,1М растворе соляной кислоты. К раствору феназепама (76,7 мг) в хлористом метилене (2,27 г) добавили 180 мкл бутилцианоакрилата. Для достижения полного растворения бутилцианоакрилата использовали перемешиватель Vortex (VWR International, Германия) и ультразвуковую баню. Полученный раствор количественно переносили в водную фазу (36,8 мг безводной лимонной кислоты; 2,35 г полоксамера 188; 20,65 мл воды) и подвергали ультразвуковой гомогенизации на гомогенизаторе (Ultra-Turrax T18 basic, Германия) в течение 1 минуты. Суспензию перемешивали на магнитной мешалке (Labtex Daihan, Корея) в течение 3 часов для удаления органического растворителя и полимеризации мономера, после чего фильтровали через бумажный фильтр «белая лента» и лиофилизировали (лиофильная сушка Alpha 2-4 LSC Christ, Германия). В качестве криопротектора использовали маннит. Размер частиц определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии (наносайзер Nanosizer NanoZS, Malvern Instruments, Великобритания). Содержание феназепама в наночастицах определяли спектрофотометрически (спектрофотометр Helios Zeta UV-VIS, Therma Scientific, США). Перед введением животным лиофильно высушенные наночастицы ресуспендировали в 0,9% растворе натрия хлорида, а затем инкубировали в течение часа с 1% раствором полисорбата 80 (ПС 80).

Изучение фармакологических эффектов феназепама, включённого в ПБЦА НЧ

Опыты проведены на самцах белых нелинейных крыс массой 250-280 г и самцах белых беспородных мышей массой 23-28 г. (питомник «Столбовая» РАМН). Животных содержали в виварии в стандартных клетках при температуре 18-20 °С при свободном доступе к пище и воде.

Анксиолитическое действие веществ изучали в тесте приподнятого крестообразного лабиринта [9]. Методика приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) основана на естественной боязни открытого пространства, новизне обстановки и страха падения с высоты [10]. Мышь помещали на центральную площадку лабиринта и в течение 3-х мин регистрировали: число выходов и длительность пребывания в открытых рукавах, число свешиваний с открытых рукавов и выходов в закрытые рукава.

Антиагрессивное действие феназепама исследовали в тесте «драки» животных [9]. Мышей парами высаживали на электродный пол и раздражали постепенно увеличивающимся по силе прерывистым электротоком до возникновения драки. Регистрировали напряжение тока, при котором у животных возникала драка.

Седативное действие оценивали с помощью метода «открытого поля» в опытах на крысах и мышах. Регистрировали в течение 3-х мин число пересечённых квадратов, вертикальных стоек и обследованных отверстий.

Миорелаксантное действие веществ изучали с помощью метода вращающегося стержня (rota rod) со скоростью вращения 3 об/мин в эксперименте на крысах и мышах.

Противосудорожное действие оценивали в двух тестах. В тесте антагонизма с коразолом изучали способность феназепама предупреждать тонико-клонический компонент судорожного припадка у крыс, вызванного коразолом (70 мг/кг, п/к). Влияние веществ на первично-генерализованную эпилептиформную активность по показателям ЭЭГ оценивали в течение 30-ти минут после введения бемегрида (10 мг/кг внб). Регистрировали длительность судорожных разрядов и число разрядов за минуту [9].

Изучение влияния флумазенила и бикукуллина на анксиолитический эффект феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы

Исследования проводили в опытах на крысах в тесте конфликтной ситуации. Феназепам, включённый в ПБЦА наночастицы, вводили группе животных внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг. Затем, с 15-минутым интервалом этим же крысам вводили флумазенил (внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг) и через 15 минут оценивали анксиолитическое действие, регистрируя количество наказуемых взятий воды. Феназепам, включённый в матрикс ПБЦА наночастиц, вводили группе животных (внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг), затем сразу же вводили бикукуллин (внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг). Через 30 минут оценивали различие анксиолитического действия между этой группой животных и контрольными группами.

Статистическая обработка экспериментальных данных выполнена с помощью компьютерной программы ВioStat for Windows. Достоверность различий оценивали с помощью вышеуказанной программы с использованием критериев Стьюдента и Фишера (при p≤0,05).

Изучение рецепторного связывания феназепама, включённого в ПБЦА НЧ с бензодиазепиновыми рецепторами (БДЗ-рецепторы) мозга в условиях in vitro и ex vivo

Процедура радиолигандного связывания. Полученную мембранную фракцию головного мозга инкубировали с [N-метил-3H]-флунитразепамом (удельная активность 81 Ки/ммоль) в течение 30 мин при температуре 0-4 °C. Неспецифическое связывание определяли в присутствии избытка немеченого феназепама (20 мкМ). Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Процесс связывания останавливали путём добавления ледяного буфера и быстрой фильтрацией через стекловолоконные фильтры типа GF/B (Whatman) с последующей двукратной промывкой ледяным буфером общим объёмом 8 мл.

Жидкостно-сцинтилляционная спектрометрия. Фильтры высушивали в течение 12 часов при комнатной температуре, затем помещали в сцинтилляционную жидкость (реактив Брея) объёмом 5 мл и использовали для сцинтилляционного счёта. Радиоактивность каждой пробы измеряли в течение 2 мин на сцинтилляционном счётчике PerkinElmer 2900TR. Эффективность счёта составляла более 45%. Неспецифическое связывание составляло не более 10% от общего.

Анализ радиорецепторного связывания. Для обработки результатов радиолигандного связывания и построения кривых связывания радиоактивного лиганда использовали программу Graphpad Prism 4 Demo. При анализе насыщения и получения характеристик связывания Bmax (величина отражает количество мест связывания лиганда на соответствующих рецепторах в исследуемой структуре мозга) и Kd (отражает аффинитет лиганда к местам связывания на рецепторном комплексе) измеряли специфическое связывание в диапазоне концентраций меченого лиганда от 0.01 до 20 нM. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Неспецифическое связывание определяли в присутствии немеченого лиганда (20 мкМ). Для построения кривых вытеснения радиоактивных лигандов каждая концентрация исследуемого вещества была взята в 3-х повторностях. Результаты представлены в виде «mean±S.E.M».

Результаты исследования 

Получение ПБЦА НЧ с феназепамом. Наночастицы были приготовлены методом кислотной полимеризации в среде, содержащей декстран 70000 в качестве стабилизатора. Показано, что оптимальная скорость перемешивания при полимеризации – 500 об/мин, оптимальным стабилизатором является декстран-70 в диапазоне концентраций от 0,5% до 2,5%. Выявлена зависимость между уровнем рН полимеризационной среды и размерами ПБЦА НЧ – размер ПБЦА НЧ увеличивается при снижении рН от 3 до 1,9. Показано, что наносуспензия с феназепамом остаётся стабильной в течение 24 часов.

Методом фотонной корреляционной спектроскопии установлено, что размеры ПБЦА НЧ с феназепамом лежат в пределах от 230 до 250 нм. Включение феназепама в НЧ составило 65%.

Изучение фармакологических эффектов феназепама, включённого в ПБЦА НЧ, в сравнении с феназепамом в субстанции. Анксиолитическое действие было изучено в тесте приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) в опытах на мышах. Установлено, что феназепам в субстанции оказывал отчётливый дозозависимый анксиолитический эффект (табл. 1). В дозе 0,1 мг/кг он увеличивал время, проведённое в открытых рукавах в 6,3 раза, в дозе 0,5 мг/кг – в 7,9 раза и в дозе 1,0 мг/кг – в 11,2 раза (рис. 1).

Рис. 1. Анксиолитическое действие феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц (НаноФен), в сравнении с феназепамом в субстанции в тесте приподнятого крестообразного лабиринта на мышах

* – различие с контролем достоверно при p < 0,05

Таблица 1. Анксиолитическое  действие феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы (НаноФен), в сравнении с феназепамом в субстанции (Фен-Субс), в тесте приподнятого крестообразного лабиринта на мышах

Примечание: * – различие с контролем достоверно при p < 0,05

НаноФен также оказывал выраженный, зависимый от дозы анксиолитический эффект (табл. 1). В дозе 0,1 мг/кг (внб) он увеличивал время, проведённое в открытых рукавах в 7,6 раза, в дозе 0,5 мг/кг – в 10,9 раза и в дозе 1,0 мг/кг – в 13,7 раза (рис. 1).

Таким образом, по выраженности анксиолитического эффекта НаноФен даже несколько превосходит феназепам в субстанции, однако, различия не носят достоверного характера.

Антиагрессивное действие было изучено в тесте немотивированной агрессивности – «драки» на электродном полу в опытах на мышах. При использовании феназепама в субстанции в дозе 2 мг/кг порог болевой реакции животных увеличился в 1,9 раз, а порог агрессивной реакции – в 1,6 раз (табл. 2).

Таблица 2. Антиагрессивное действие феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы (НаноФен) и феназепама в субстанции (Фен-Субс) в тесте «драки» у мышей

Примечание: * – различие с контролем достоверно при p < 0,05 

НаноФен в дозе 2 мг/кг увеличивал порог болевой реакции животных в 3,8 раз, а порог агрессивности – в 1,72 раза (табл. 2) и, таким образом, не уступал феназепаму в субстанции по антиагрессивному действию.

При изучении противосудорожного действия установлено, что феназепам в субстанции и НаноФен в 100% случаях блокировали судороги, вызванные коразолом, в то время как в контрольной группе при введении аналогичной дозы коразола у 90% крыс наблюдались тонико-клонические судороги.

После введения бемегрида в дозе 10 мг/кг в сенсомоторной коре, дорзальном гиппокампе и латеральном гипоталамусе регистрировались эпилептиформные разряды высокоамплитудных острых и медленных волн, амплитудой более 200 мкВ, длительностью от 0,3 до 2,5 сек. (рис. 2). Число разрядов за минуту составило в среднем 12,3±4,6, а длительность разрядов за минуту – 6,1±0,4. НаноФен почти полностью устранял первично-генерализованные судороги (рис. 3) и значительно увеличивал латентное время появления эпиразрядов. Число разрядов в минуту составило 1,1±0,07, т.е. в 11 раз меньше, чем в контроле, а длительность 0,45±0,07, т.е. в 13 раз меньше, чем в контроле. 

Рис. 2. Электрограммы крысы, зарегистрированные через 10 минут после введения бемегрида

Рис. 3. Электрограммы крысы, зарегистрированные при введении НаноФен и бемегрида

Феназепам в субстанции также ослаблял эффекты бемегрида: число разрядов за минуту снижалось до 3,2±0,5, а длительность до 0,5±0,08. Таким образом, можно отметить, что противосудорожная активность НаноФен была несколько выше, чем у феназепама в субстанции.

При изучении седативного эффекта под влиянием феназепама в субстанции в дозе 1 мг/кг наблюдалось существенное уменьшение, по сравнению с контролем, числа пересечённых мышами квадратов (в 7 раз), количества вертикальных стоек (в 5 раз) и количества обследованных отверстий (в 15 раз) в открытом поле, что свидетельствует о его выраженном седативном действии. НаноФен практически не вызывал снижения числа пересечённых квадратов и числа вертикальных стоек (табл. 3).

Таблица 3. Седативный эффект феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы (НаноФен), и феназепама в субстанции (Фен-Субс) в тесте «открытое поле» в опытах на мышах в дозе 1 мг/кг

Примечание: * – различие с контролем достоверно при p < 0,05

Изучение миорелаксантного действия. В опытах на крысах феназепам в субстанции в дозе 1 мг/кг вызывал падение со стержня 50% крыс с латентным периодом 11,2 с., а в дозе 2 мг/кг – 80% животных с латентным периодом 4,1 с. НаноФен в дозах 1 и 2 мг/кг практически не оказывал миорелаксантного действия: количество крыс, неспособных удержаться на вращающемся стержне при использовании вещества в дозах 1 и 2 мг/кг составило 10%.

В опытах на мышах при использовании феназепама в субстанции в дозе 1 мг/кг наблюдалось падение со стержня 50% мышей с латентным периодом 8,4 с., а в дозе 2,5 мг/кг – 90% животных с латентным периодом 2,8 с. В дозе 5 мг/кг феназепам в субстанции оказывал еще более глубокое миорелаксантное действие. У животных наблюдалось расслабление задних конечностей и 50% животных не были способны перемещаться даже на плоской поверхности (лабораторном столе). НаноФен в дозе 1 мг/кг не вызывал нарушения координации движений и миорелаксантного действия. В дозе 2,5 мг/кг НаноФен вызывал нарушение координации движений у 20% мышей при первой посадке и у 10% мышей при второй посадке. В высокой дозе 5 мг/кг НаноФен вызывал нарушение координации движений у 70% мышей.

Таким образом, полученные результаты показали, что феназепам, включённый в ПБЦА наночастицы, обладает выраженным анксиолитическим, антиагрессивным и противосудорожным действием, аналогичным действию феназепаму в субстанции, однако, в отличие от феназепама в субстанции, в терапевтических дозах не обладает седативным и миорелаксантным действием.

С целью выяснения вопроса о возможном вовлечении ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса в реализацию анксиолитического действия наноразмерной формы феназепама были использованы фармакологические анализаторы – флумазенил и бикукуллин. Флумазенил – этил-8-фтор-5,6-дигидро-5-метил-6-оксо-4Н-имидазо[1,5-a-1,4] бензодиазепин-3-карбоксилат является конкурентным блокатором специфических бензодиазепиновых рецепторов и устраняет все центральные эффекты бензодиазепиновых транквилизаторов: анксиолитический, снотворный, седативный и миорелаксантный, а также способствует восстановлению дыхания и сознания при передозировке бензодиазепинов. Бикукуллин – алкалоид, выделяемый из растения Dicentra cucullaria, является антагонистом ГАМК-А рецепторов и снижает центральные эффекты бензодиазепиновых анксиолитиков.

В ходе проведённого исследования установлено, что флумазенил (10 мг/кг, внб), введённый после феназепама (1 мг/кг), достоверно снижает анксиолитический эффект как феназепама в субстанции, так и НаноФен, о чём свидетельствует значительное уменьшение (более чем в 6 раз) числа наказуемых взятий воды по сравнению с показателями одних веществ (рис. 4). Бикукуллин (1 мг/кг, внб) также ослабляет анксиолитический эффект феназепама в субстанции и НаноФен (рис. 4), но его эффект был менее выражен, чем эффект флумазенила. Полученные данные позволяют предположить, что в реализацию анксиолитического действия НаноФен также как и в механизм действия феназепама в субстанции, вовлекаются бензодиазепиновые и ГАМК-А рецепторы.

Рис. 4. Влияние флумазенила (флум) в дозе 10 мг/кг и бикукуллина (бик) в дозе 1 мг/кг на анксиолитическое действие феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы в дозе 1 мг/кг, и феназепама в субстанции в дозе 1 мг/кг, в тесте конфликтной ситуации в опытах на крысах

 * – различие с контролем достоверно при p < 0,05

 # – различие с препаратом без антагониста достоверно при p < 0,05

С целью получения доказательных представлений о механизме действия наноразмерной формы феназепама проводили изучение рецепторного связывания феназепама, включённого в ПБЦА НЧ с бензодиазепиновыми рецепторами мозга в условиях in vitro и ex vivo.

Эксперименты in vitro. Результаты сравнения динамики специфического связывания и величин IC50 двух серий экспериментов в условиях in vitro представлены на рис. 5. Как феназепам, так НаноФен вмешиваются в процесс связывания [N-метил-3H]-флунитразепама с рецепторами гиппокампа с близкими величинами 2,8 и 6,6 нмоль/л. Полученные данные in vitro свидетельствуют о том, что включение феназепама в ПБЦА наночастицы не изменяет способности феназепама специфически связываться с БДЗ-рецепторами мозга.

Рис. 5. Влияние феназепама и НаноФен на связывание [N-метил-3H]-флунитразепама мембранами гиппокампа крыс in vitro

Эксперименты ex vivo. Результаты изучения состояния БДЗ-рецепторов после 5-кратного системного введения феназепама и НаноФен представлены на рис. 6. Эффекты обоих веществ описываются классическим кривыми насыщения, указывающими на монотонное и моноцентровое связывание лиганда. При этом обе экспериментальные кривые лежат существенно выше, чем в контрольной группе сравнения.

Рис. 6. Сравнительное влияние субхронического введения феназепама (1 мг/кг, 5 дней) и НаноФен (1 мг/кг, 5 дней) на характеристики радиолигандного связывания с мембранами гиппокампа крыс ex vivo

Количественные параметры рецепторного связывания, рассчитанные по программе Graphpad Prism 4 Demo, приведены в табл. 4, из которой следует, что под влиянием субхронического введения изменениям подвергаются обе константы, описывающие состояние БДЗ-рецепторов: во-первых, величины констант диссоциации Kd уменьшаются в обеих группах на 22% (р<0.01), что интерпретируется как возрастание степени структурного сродства рецептора к лиганду ([N-метил-3H]-флунитразепаму); во-вторых, возрастают величины Bmax, отражающие плотность мест связывания лиганда. Причём, под влиянием феназепама количество рецепторов увеличивается на 46% (p<0.01), а под воздействием НаноФен – на 70% (p<0.01). При этом действие НаноФен оказывается заметно эффективнее (p<0.05).

Таблица 4. Характеристики рецепторного связывания феназепама и НаноФен с БДЗ-рецепторами гиппокампа крыс после субхронического введения (1мг/кг/день*5) ex vivo

Примечания: * – отличие от контроля P<0.01; ** – отличие от феназепама р < 0.05

Обсуждение результатов 

При изучении спектра фармакологических эффектов феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы, было установлено, что он обладает выраженным анксиолитическим эффектом в тесте приподнятого крестообразного лабиринта, аналогичным эффекту феназепама в субстанции, который является дозозависимым и усиливается при повышении дозы от 0,1 до 1,0 мг/кг. По выраженности анксиолитического эффекта феназепам, включённый в ПБЦА наночастицы, даже несколько превосходит феназепам в субстанции, однако, различия не носят достоверного характера. Наряду с анксиолитическим эффектом, феназепам, включённый в ПБЦА наночастицы, и феназепам в субстанции обладают сходным антиагрессивным эффектом в тесте «драки» пары мышей на электродном полу и противосудорожным эффектом в тестах антагонизма с коразолом и бемегридом. В тоже время, феназепам, включённый в ПБЦА наночастицы, в сравнении с феназепамом в субстанции, не обладает в терапевтических дозах седативным и миорелаксантным действием. В высокой дозе (5 мг/кг) НаноФен оказывает значительно меньшее миорелаксантное действие (нарушение координации движений у 70% животных), чем феназепам в субстанции (нарушение координации у 100% животных, расслабление задних конечностей и неспособность передвижения даже на плоской поверхности).

 Таким образом, феназепам, инкапсулированный в ПБЦА наночастицы, покрытые полисорбатом 80, в сравнении с феназепамом в субстанции, обладает выраженным анксиолитическим, антиагрессивным и противосудорожным действием, аналогичным действию феназепаму в субстанции, однако, в отличие от феназепама в субстанции, в терапевтических дозах не обладает седативным и миорелаксантным действием.

Для объяснения вышеуказанных эффектов феназепама, включённого в матрикс ПБЦА, нами были проведены исследования, которые позволяют предположить, что в реализацию анксиолитического действия феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы, также как и в действие феназепама в субстанции, вовлекаются бензодиазепиновые и ГАМК-А рецепторы. Об этом свидетельствует тот факт, что флумазенил – антагонист бензодиазепиновых рецепторов достоверно снижает анксиолитическое действие феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы. Наряду с этим, достоверно снижает анксиолитическое действие феназепама бикукуллин – антагонист ГАМК-А рецепторов. Полученные данные позволяют предположить, что фармакологические эффекты инкапсулированного в наночастицы феназепама реализуются через бензодиазепиновые рецепторы, которые аллостерически связаны с ГАМК-А рецепторами.

Результаты проведённых исследований по изучению рецепторного связывания в условиях in vitro подтвердили предположение о том, что действие инкапсулированного в наночастицы феназепама опосредуется через БДЗ-рецепторы. При этом установлено, что поли(бутил)цианоакрилатные наночастицы не влияют на способность феназепама специфически связываться с БДЗ-рецепторами мозга. Выявленное в экспериментах ex vivo существенное возрастание константы Bmax при субхроническом введении наноформы феназепама свидетельствует об увеличении плотности участков связывания феназепама в структуре БДЗ-рецепторов гиппокампа. Таким образом, некоторое повышение фармакологической активности феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы, можно отчасти объяснить его более полным связыванием с БДЗ-рецепторами мозга.

К настоящему времени можно считать доказанным, что поли(бутил)цианоакрилатные наночастицы, покрытые полисорбатом 80, способны осуществлять доставку ЛВ в мозг [11-16]. Ключевую роль в этом процессе играют аполипопротеины Аро-Е и АроА-1, сорбирующиеся на поверхность частицы из плазмы крови [17, 18]. Наличие аполипопротеинов на поверхности наночастиц придаёт им сходство с липопротеинами плазмы крови, что и обеспечивает их рецептор-зависимый эндоцитоз эндотелиоцитами капилляров мозга [19]. Внутри эндотелиальной клетки частица подвергается биодеградации под действием ферментов и выделяет ЛВ, которое затем диффундирует через мембрану в межклеточное пространство.

В структурах мозга выявлена различная плотность рецепторов к Аро-Е и АроА-I. Показано, что в головном мозге рецепторы к АпоЕ и АроА-I находятся в наибольшем количестве в гиппокампе и коре [20-22]. Эти данные хорошо коррелируют с результатами о том, что именно в гиппокампе, а также в коре и в значительно меньшей степени в других структурах под влиянием нанокапсулированного феназепама происходит усиление спектров мощности ЭЭГ [23].

Учитывая вышеизложенное можно предположить, что феназепам, включённый в ПБЦА наночастицы, доставляется преимущественно в гиппокамп и кору, т.е. в структуры наиболее значимые для проявления анксиолитического эффекта, и в которых плотность рецепторов к АпоЕ и АроА-I максимальна. Этот факт в определённой степени объясняет наблюдаемое расслоение основных и побочных эффектов инкапсулированного в поли(бутил)цианоакрилатные наночастицы феназепама.