Основные механизмы доставки лекарственных веществ в мозг с помощью полимерных наночастиц

Мозг является одним из наименее доступных объектов для фармакотерапии из-за наличия гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), который регулирует обмен веществ между кровью и нервной тканью (мозгом). Основными структурными элементами ГЭБ являются мембраны клеток эндотелия, периваскулярная базальная мембрана, а также мембраны ножек глиальных клеток, окружающих сосуды [1]. Отличительной особенностью эндотелиальных клеток капилляров мозга и хориоидального (сосудистого) сплетения желудочков мозга являются плотные межклеточные контакты, образующиеся при участии трансмембранных белков (рис. 1). Эти эндотелиальные клетки отличаются низкой пиноцитарной активностью. Кроме того, в капиллярах мозга практически отсутствуют фенестры. Благодаря этому ГЭБ создаёт надёжную преграду на пути циркулирующих в крови продуктов обмена веществ и ксенобиотиков, не позволяя им проникать в мозг путём диффузии. Поглощение и экскреция жизненно важных соединений, таких как аминокислоты, гексозы, нейропептиды и белки осуществляется при участии специфических транспортных систем. Путём пассивной диффузии преодолевать ГЭБ могут только низкомолекулярные липофильные соединения (м.м.<500 Да) [2, 3]. Однако многие липофильные молекулы немедленно удаляются из эндотелиальных клеток с помощью трансмембранных белков, таких как Р-гликопротеин (P-gp) [4]. Р-гликопротеин функционирует как АТФ-зависимый насос, выбрасывая липофильные молекулы из эндотелиальных клеток, что препятствует их проникновению и накоплению в тканях мозга (рис. 1).

Рис. 1. Строение стенки капилляра мозга

Вследствие этого многие потенциально эффективные лекарственные вещества (ЛВ), предназначенные для лечения заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), проявляя высокую активность in vitro, оказываются неэффективными при введении в организм, поскольку ГЭБ препятствует поступлению этих веществ в мозг в терапевтически значимых концентрациях. Разработка безопасных и неинвазивных методов доставки ЛВ в мозг представляет собой серьезную проблему, для решения которой нужны новые стратегии.

Перспективным направлением исследований в этой области является разработка наносомальных систем доставки. Так было показано, что доставку в мозг ЛВ, не способных преодолевать ГЭБ, можно осуществить с помощью коллоидных систем доставки на основе полибутилцианоакрилатных (ПБЦА) наночастиц (НЧ), поверхность которых модифицирована полисорбатом 80 (ПС-80). Используя указанный носитель, удалось доставить в мозг гексапептид даларгин, четвертичное аммониевое соединение – прозерин, а также лоперамид и доксорубицин – это вещества, которые, являясь субстратами Р-гликопротеина, не способны преодолеть ГЭБ [5-11]. Впоследствии применение ПБЦА наночастиц, покрытых ПС-80, позволило обеспечить транспорт в мозг веществ макромолекулярной природы-белков с нейротрофической активностью: фактора роста нервов и рекомбинантного эритропоэтина человека [12-14, 26]. Факт поступления этих веществ в мозг с помощью наночастиц был доказан путём фармакологических тестов, демонстрирующих центральное действие наносомальных форм, в то время как свободные вещества такого действия не оказывали. Эти результаты послужили основанием для создания совершенно новой концепции о том, что наночастицы могут служить средством доставки в мозг веществ, которые в свободном виде не способны преодолеть ГЭБ.

Согласно современным представлениям можно предположить, что наночастицы доставляют вещества через ГЭБ с помощью следующих механизмов:

1. Неспецифическое повышение проницаемости ГЭБ (то есть повышение проницаемости мембран эндотелиальных клеток капилляров мозга или нарушение плотных контактов между этими клетками) в результате воздействия НЧ или поверхностно-активных веществ (ПАВ) (токсический эффект). В этом случае циркулирующие в крови частицы и ЛВ могут проникнуть в мозг.
2. Поступление ЛВ в мозг в результате повышения градиента концентрации кровь-мозг (то есть при повышении концентрации ЛВ в крови).
3. Взаимодействие НЧ с мембранами эндотелиальных клеток капилляров мозга (неспецифическое или рецептор-опосредованное) и, как результат, поступление их внутрь клетки (эндоцитоз) или удерживание вблизи клеточной мембраны. Можно представить, что в первом случае происходит деградация НЧ внутри клетки, затем выделение ЛВ и поступление его в мозг через апикальную мембрану эндотелиальной клетки капилляра. Во втором случае ЛВ выделяется из НЧ в непосредственной близости от клетки; при этом может создаваться микроокружение, способствующее проникновению ЛВ через клеточную мембрану в мозг.
4. Ингибирование АТФ-зависимых трансмембранных белков, таких как P-gp, препятствующих поступлению субстратов в эндотелиальные клетки сосудов мозга.

Механизм 1: неспецифическое повышение проницаемости ГЭБ

Первый из названных выше механизмов, а именно неспецифическое повышение проницаемости ГЭБ в результате токсического действия наночастиц и/или ПАВ, сразу казался маловероятным, поскольку ни в одном из многочисленных экспериментов in vivo мы не наблюдали клинических признаков нейротоксичности. С другой стороны, если бы барьерные функции ГЭБ действительно нарушались, то в связывании ЛВ с НЧ не было бы необходимости: при введении после НЧ эти вещества могли бы проникать через нарушенный ГЭБ в результате простой диффузии.

С целью подтверждения этой гипотезы был проведён эксперимент, позволяющий судить о состоянии ГЭБ после введения ПБЦА НЧ, покрытых ПС-80. В этом эксперименте определяли анальгезирующее действие даларгина, свободного или включённого в ПБЦА НЧ, при различных режимах введения [15]. Даларгин является агонистом опиоидных рецепторов, однако не оказывает анальгезирующего действия при внутривенном введении, поскольку практически не проникает в мозг, являясь субстратом P-gp. В то же время, как ранее показал Аляутдин Р.Н. и соавторы, даларгин, связанный с ПБЦА НЧ, покрытыми ПС-80, значительно понижает порог болевой чувствительности мышей [16]. Более того, анальгезирующий эффект даларгина устранялся антагонистом опиоидных рецепторов – налоксоном, что свидетельствует о воздействии связанного с НЧ даларгина на опиоидные рецепторы ЦНС, то есть о его проникновении через ГЭБ. Анальгезирующее действие оценивали в тесте отдёргивания хвоста (tail-flick test). Увеличение промежутка времени, которое требуется мышам для того, чтобы ощутить боль при нагревании хвоста и отдёрнуть его, свидетельствует о повышении порога их болевой чувствительности по сравнению с интактным состоянием. Как видно из данных, приведённых в таблице, значительное понижение порога болевой чувствительности достигалось только при введении даларгина, сорбированного на НЧ, покрытых ПС-80. Анальгезирующее действие самого даларгина или НЧ, введённых по отдельности, было незначительно. Последовательное введение НЧ и свободного даларгина (через 5 и 30 минут после введения НЧ) не привело к увеличению анальгезирующего эффекта.

Таблица. Анальгезирующий эффект (% от максимально возможного эффекта,% МРЕ) после внутривенного введения мышам даларгина (доза 7,5 мг/кг) и ПБЦА наночастиц, покрытых полисорбатом 80 (n=6)

Примечания: * = 2р < 0,05; ** = 2р < 0,01 по сравнению с даларгином в растворе

Результаты этого эксперимента позволяют сделать два важных вывода:

1. внутривенное введение ПБЦА НЧ, покрытых ПС-80, не приводит к повышению проницаемости ГЭБ, достаточному для проникновения через него низкомолекулярных субстратов P-gp;
2. субстраты P-gp проникают в мозг, только будучи связанными с НЧ, покрытыми ПС-80.

Кроме того, целостность ГЭБ при контакте с НЧ была исследована в опытах in vitro [15]. В опытах использовали модель ГЭБ, состоящую из совмещённых слоёв эндотелиальных клеток капилляров мозга быка и астроцитов крысы. В качестве маркеров проницаемости ГЭБ использовали [3Н]-инулин и [14С]-сахарозу. Было показано, что количество этих гидрофильных маркёров, проникающих через ГЭБ, не изменяется после инкубации клеток с НЧ, как в присутствии, так и в отсутствие ПС-80.

Таким образом, как показывают результаты исследований in vivo и in vitro, механизм доставки наночастиц и/или связанных с ними веществ в мозг не связан с нарушением барьерной функции ГЭБ.

Механизм 2: доставка в мозг в результате повышения градиента концентраций кровь-мозг 

Непроницаемость ГЭБ относительна, поскольку способность ЛВ проникать через ГЭБ в значительной степени зависит от концентрации этих веществ в крови. В соответствии с правилом фармакокинетики, сформулированным У. Пардриджем [3]: количество вещества, доставляемого в мозг, пропорционально коэффициенту проницаемости ГЭБ и величине интегрального показателя площади под фармакокинетической кривой «концентрация в плазме-время» (AUC). Таким образом, количество поступающего в мозг ЛВ может возрастать при увеличении его концентрации и/или времени циркуляции в крови.

Одним из путей, позволяющим увеличить время циркуляции ЛВ, является применение в качестве носителей длительно циркулирующих наночастиц. Наиболее распространённый подход к созданию таких частиц состоит в гидрофилизации их поверхности путём создания пространственного (стерического) барьера, препятствующего сорбции белков. Стерическая стабилизация наночастиц создаёт так называемый «стелс-эффект» (от англ. stealth – невидимый), позволяющий НЧ стать «невидимыми» для макрофагов и избежать захвата. Технология «стелс» обеспечивает продолжительную циркуляцию НЧ в крови, а значит, в соответствии с упомянутым выше правилом фармакокинетики, должна способствовать доставке частиц и связанного с ними ЛВ в мозг. Однако в случае ПБЦА НЧ, модифицированных ПС-80, такая закономерность не наблюдается. Действительно, как показывают данные фармакокинетического исследования наносомальной формы доксорубицина [17], а также данные ряда авторов, изучавших влияние ПС-80 на распределение НЧ [18, 19], эффективность этого ПАВ как «стелс-агента» невысока. Модификация ПБЦА НЧ полисорбатом привела лишь к незначительному повышению концентрации доксорубицина в плазме: показатель AUC для плазмы возрос лишь на 70% по сравнению с немодифицированными частицами (рис. 2).

Рис. 2. Показатели АUC различных форм доксорубицина при в/в введении крысам в дозе 5 мг/кг

Dox – раствор доксорубицина; Dox+Ps80 – раствор доксорубицина с полисорбатом 80; Dox-NP – доксорубицин, включённый в наночастицы; Dox-NP+Ps80 – доксорубицин, включённый в наночастицы, модифицированные полисорбатом 80

Однако показатель AUC для мозга почти в 10 раз превышал соответствующий показатель для плазмы [17]. При этом только введение модифицированных НЧ привело к достижению в мозге весьма высокой концентрации доксорубицина – 6 мкг/г, в то время как при введении немодифицированных НЧ концентрации оставались ниже 0,1 мкг/г (рис. 3).

Таким образом, модификация НЧ полисорбатом позволила повысить концентрацию доксорубицина в мозге, по крайней мере, в 60 раз.

Рис. 3. Уровень концентрации доксорубицина, ассоциированного с наночастицами, модифицированными полисорбатом 80, в головном мозге крыс при в/в введении в дозе 5 мг/кг

Dox – раствор доксорубицина; Dox-NP – доксорубицин, включённый в наночастицы; Dox-NP+Ps80 – доксорубицин, включённый в наночастицы, модифицированные полисорбатом 80

Тем не менее, исследования, проведённые впоследствии рядом авторов, подтвердили справедливость сформулированного выше правила фармакокинетики. Действительно, при внутривенном введении применение стелс-частиц способствует росту концентраций ЛВ в мозге при одновременном росте интегрального показателя AUC плазмы. Так включение доксорубицина в стелс-НЧ из твёрдых липидов позволила повысить AUC в плазме в 9 раз по сравнению со свободным антибиотиком, параллельно возросла и его концентрация в мозге [20]. Однако, следует отметить, что концентрация в мозге доксорубицина при введении его в составе липидных НЧ, не превышала 0,25% от дозы, в то время как ПБЦА НЧ, покрытые полисорбатом, доставляли в мозг 1% дозы доксорубицина и поддерживали этот уровень в течение 2 ч.

С другой стороны, некоторые стерически стабилизированные НЧ долго циркулируют в крови, но не проникают через ГЭБ. Так в исследовании П. Калво и соавт. адсорбция полоксамина 908 на поверхности полигексадецилцианоакрилатных НЧ позволила существенно повысить время их циркуляции и концентрацию в плазме, однако концентрации частиц в мозге были незначительны [18]. В то же время, НЧ из полигексадецилцианоакрилата, модифицированные ковалентно связанным полиэтиленгликолем, лучше проникали в мозг, хотя их концентрации в плазме были существенно ниже, чем у НЧ, модифицированных полоксамином 908.

Фармакокинетическое исследование, проведённое И. Бриггер и соавт. на крысах с интракраниальной глиобластомой, также показало, что сродство полигексадецилцианоакрилатных НЧ, модифицированных полиэтиленгликолем (ПЭГ), к неповреждённым участкам мозга нельзя рассматривать как результат исключительно диффузии этих носителей [21]. Не исключено, что, модификация поверхности ПЭГ способствует контакту НЧ с эндотелиальными клетками капилляров мозга, тогда как стерический эффект полоксамина 908 не только обеспечивает защиту НЧ от опсонизации, но и препятствует такому контакту.

Было бы естественно предположить, что увеличение гидрофильности затруднит взаимодействие частиц с эндотелиальными клетками и помешает им преодолеть ГЭБ. Однако в действительности этого не происходит, что подтверждает предположение о том, что модификация ПЭГ играет важную роль в специфическом взаимодействии НЧ с эндотелиальными клетками ГЭБ.

Анализ описанных выше данных позволяет заключить, что в осуществлении переноса НЧ через ГЭБ могут участвовать различные механизмы. С одной стороны, как отмечалось выше, транспорт через ГЭБ с помощью длительно циркулирующих НЧ может быть результатом повышения концентрации частиц и связанных с ними ЛВ в плазме, и обусловлен ростом градиента концентраций в системе плазма-мозг. С другой стороны, ряд экспериментальных данных указывает на то, что эффективность носителей определяется не только (и не столько) длительностью циркуляции и достижением высоких концентраций в плазме, но и возможностью контакта частицы с клеточными мембранами, которая, в свою очередь, зависит от структуры поверхности (в том числе и от модифицирующего агента).

Так совершенно ясно, что феноменальный эффект полисорбата в случае ПБЦА НЧ – 60-кратное увеличение концентрации доксорубицина в мозге, трудно объяснить незначительным повышением градиента концентраций в системе кровь-мозг. Вероятно, эти носители используют другой механизм для проникновения в мозг.

Механизм 3: доставка в мозг в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза

Описанные выше явления хорошо объясняет гипотеза, согласно которой ПБЦА НЧ, модифицированные ПС 80, интернализуются эндотелиальными клетками капилляров мозга в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза.

В 2002 году Й. Кройтер и соавт. показали, что полисорбат 80 способствует сорбции на поверхности ПБЦА НЧ белков плазмы – аполипопротеинов Е и В [22]. Эти данные позволили предположить, что НЧ проникают в мозг в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза, который является результатом взаимодействия этих белков с рецепторами к липопротеинам низкой плотности (ЛПНП-рецепторами или LDL-рецепторами), экспрессированными в мембранах эндотелиальных клеток капилляров мозга. ЛПНП-рецепторы воспринимают НЧ как агрегаты липопротеинов низкой плотности, поступающие в мозг из крови. Внутри эндотелиальной клетки частица подвергается биодеградации под действием ферментов и выделяет ЛВ, которое затем диффундирует через мембрану в межклеточное пространство (рис. 4).

Рис. 4. Рецептор-зависимый эндоцитоз ЛПНП, опосредованный АроЕ

Впоследствии было показано, что, несмотря на различную химическую структуру ПАВ, использованных для модификации, профили белков плазмы, сорбированных на поверхности ПБЦА НЧ, обнаружили как количественное, так и качественное сходство [23]. При этом в значительном количестве присутствовал АроА-I (24% от общего количества). Возможно, что доставка веществ в мозг осуществляется путём взаимодействия АроА-I, адсорбированного на поверхности НЧ, со скавенджер-рецептором BI (SR-BI), экспрессированным на поверхности эндотелиальных клеток, формирующих ГЭБ. Этот рецептор, экспрессируемый также и другими клетками (в том числе, гепатоцитами), участвует в переносе липидов от АроА-I внутрь клетки. При переносе липида в клетку АроА-I связывается с клеточной мембраной посредством рецептора SR-BI, который и передаёт липид клетке. После этого сам белок, уже лишённый липида, диссоциирует с поверхности клетки и возвращается в кровь. Вполне вероятно, что поступление наночастиц в эндотелиальные клетки осуществляется по той же схеме: АроА-I, адсорбированный на поверхности НЧ, взаимодействует с рецептором SR-BI, но вместо липида в клетку поступает частица (рис. 5).

Рис. 5. Рецептор-зависимый эндоцитоз ЛПВП, опосредованный АроА-I (по С.Э. Гельпериной)

СЕ – холестерол этерифицированный; F68 – плюроник F68

В пользу этой гипотезы, несомненно, свидетельствует тот факт, что альбуминовые наночастицы, модифицированные АроА-I, также преодолевают ГЭБ и доставляют в мозг лоперамид [24]. Являясь субстратом Р-gp, агонист опиоидных рецепторов лоперамид не способен самостоятельно преодолеть ГЭБ и поэтому не оказывает анальгезирующего действия. Значительное снижение порога болевой чувствительности мышей, выявленное в тесте отдёргивания хвоста после внутривенного введения лоперамида, связанного с НЧ, модифицированными АроА-I, указывает на его проникновение в мозг.

Механизм 4: ингибирование P-gp

Роль АТФ-зависимых транспортеров в доставке веществ через ГЭБ с помощью НЧ в настоящее время до конца не изучена. Тем не менее, все низкомолекулярные вещества, доставленные в мозг с помощью ПБЦА НЧ (в том числе даларгин, лоперамид, доксорубицин), являются субстратами P-gp, что и объясняет невозможность их независимого транспорта через ГЭБ. В пользу этой гипотезы может свидетельствовать тот факт, что доксорубицин в составе ПБЦА НЧ преодолевает P-gp-зависимую резистентность опухолевых клеток [25]. Этот феномен является результатом двух одновременно протекающих процессов: выделения доксорубицина из НЧ и её биодеградации с образованием полицианоакриловой кислоты. Доксорубицин и полицианоакриловая кислота образуют ионную пару, которая и проникает через клеточную мембрану, минуя P-gp (рис. 6).

Рис. 6. Предположительный механизм, с помощью которого доксорубицин в составе полиалкилцианоакрилатных наночастиц преодолевает резистентность опухолевых клеток, экспрессирующих Р-gp [25]

Не исключено, что этот же механизм способствует и доставке доксорубицина в мозг. В этом случае присутствие АроА-I на поверхности НЧ также может играть важную роль. Действительно, удерживание НЧ вблизи клеточной мембраны в результате взаимодействия со скавенджер-рецептором при одновременной биодеградации и выделении доксорубицина должно способствовать его проникновению в эндотелиальные клетки ГЭБ в обход P-gp. Затем доксорубицин проникает в мозг через апикальную мембрану клетки. При таком развитии событий захват НЧ этими клетками не является необходимым условием доставки веществ в мозг, а доставка доксорубицина в мозг будет суммарным результатом действия двух механизмов.