Введение

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» на основе аналогов природных нейропептидов разработаны три дипептидных препарата: ноопепт — этиловый эфир фенил-ацетил-L-пролил-L-глицин, являющийся пептидным аналогом пирацетама и вазопрессина, с 2006 года внедрён в медицинскую практику в качестве ноотропного средства, препарат дилепт — метиловый эфир капроноил-L-пролил-L-тирозина — аналог природного антипсихотика нейротензина с положительным мнемотропным действием прошел стадии доклинического и клинического изучения, в настоящее время решается вопрос о его внедрении в медицинскую практику. Третий препарат — соединение ГБ-115 — гексаноил-L-глицил-L-триптофан амид, являющийся ретроаналогом холецистокинина-4, также прошёл стадии доклинического и клинического изучения, разработана новая технология его таблеточной лекарственной формы на основе микронизированной субстанции с улучшенными фармакокинетическими характеристиками — энзиматической устойчивостью и большей величиной тканевой биодоступности. В настоящее время также рассматривается вопрос о его внедрении в клиническую практику для лечения тревожных состояний, фобий и других патологических состояний.

Экспериментальная часть

Проницаемость ГЭБ для новых нейротропных пептидных препаратов

Изучение фармакокинетики новых лекарственных препаратов является необходимым этапом для их внедрения и эффективного и безопасного применения в клинике [1]. Особое значение это направление исследований имеет для пептидных лекарственных препаратов в связи с их энзиматической нестабильностью и образованием метаболитов, обладающих собственной фармакологической активностью. Кроме того, эффективность фармакотерапии зависит от доставки лекарственных веществ (ЛВ) в орган-мишень — мозг, которая определяется его способностью проникать через ГЭБ. ГЭБ осуществляет барьерную функцию, ограничивающую проникание фармакологически активных ЛВ в концентрациях, превышающих эффективные, и способствует сохранению гомеостаза. Экспериментальные данные о проницаемости пептидных ЛВ через ГЭБ могут иметь значение для выяснения механизма действия и их роли в проявлении фармакологических эффектов изучаемых лекарственных препаратов (ЛП). В данной работе приводятся результаты исследования особенностей проникания изучаемых препаратов через гематоэнцефалический барьер в ЦНС (мозг крыс), которые оценивали по соотношению их площадей под фармакокинетическими кривыми в мозге и плазме крови крыс, характеризующее тканевую биодоступность к мозгу крыс, и выражали в виде коэффициента Кмозг/плазма.

Ноопепт

На основе структурной формулы молекулы ноопепта были рассчитаны его основные физико-химические характеристики, а также его метаболита — ЦПГ, позволяющие прогнозировать проникание изучаемых соединений через ГЭБ. В соответствии с «правилом пяти», предложенному LipinskiCА [2], ЛВ имеет хорошую абсорбцию, если его молекулярная масса менее 500 а. е. м., коэффициент распределения октанол/вода log/Р менее 5, число доноров водородной связи, выраженной суммой OHи NН-, менее 5, число акцепторов водородной связи, выраженной количеством Nи O-атомов, менее 10. Молекулярный вес ноопепта 318 а. е. м., значение коэффициента распределения в системе октанол-вода — 2,51, число доноров водородной связи 2, число акцепторов водородной связи – 3. Молекулярная масса ЦПГ составляет 154 а. е. м., коэффициент распределения октанол/вода log/Р равен 2,05, число доноров водородной связи — 2, число акцепторов водородной связи равно 2. Таким образом, ноопепт и его активный метаболит ЦПГ удовлетворяют используемому методу Lipinski «правилу пяти» и теоретически возможно их проникание через ГЭБ.

Целью наших исследований стало экспериментальное изучение проникания исследуемых соединений через ГЭБ крыс.

При изучении фармакокинетики ноопепта было установлено, что препарат быстро метаболизируется в организме крыс с образованием активного метаболита циклической структуры — цикло-пролил-L-глицин (ЦПГ), который определяется в плазме крови крыс в более высокой концентрации и значительно более продолжительное время — в течение 4–6 ч после введения по сравнению с ноопептом, период полувыведения которого составлял 25–30 мин после перорального введения субстанции препарата [3, 4]. В результате пресистемной элиминации ноопепта происходит отщепление фенилацетильного радикала от молекулы ноопепта с образованием пролил-глицина, который превращается в циклическую форму — ЦПГ. ЦПГ был впервые обнаружен нами в плазме и мозге крыс с использованием метода ВЭЖХ-МС/МС, установлена его структура, изучена его фармакокинетика и рассчитаны основные фармакокинетические параметры в плазме крови и мозге крыс в сравнении с аналогичными параметрами ноопепта после перорального введения субстанции препарата [3–6]. Рассчитанные фармакокинетические параметры ноопепта и ЦПГ представлены в табл. 1.

Из представленных в таблице фармакокинетических параметров ноопепта и его метаболита ЦПГ в плазме крови и мозге крыс видно, что величины максимальных концентраций и площадей под фармакокинетическими кривыми в мозге крыс как неизмененного препарата, так и его метаболита значительно превышают аналогичные параметры в плазме крови крыс. Полученные данные указывают на проникание через ГЭБ обоих соединений с высоким коэффициентом распределения, рассчитанными по соотношению площадей под фармакокинетическими кривыми, составляющими для ноопепта Кмозг/плазма — 1,61 и для ЦПГ — 1,38, что свидетельствует о высокой тропности ноопепта и его активного метаболита к ткани мозга крыс. Этот факт обусловлен близкими физико-химическими свойствами: небольшим молекулярным весом, количеством донорных и акцепторных связей обоих соединений, но в силу меньшей полярности, большей липофильности и лучшей растворимости в органических растворителях ноопепт проникает в мозг в большей степени, чем ЦПГ. Кроме того, можно отметить незначительные различия параметров, характеризующих элиминацию в мозге и плазме крови крыс для ноопепта; в то время как ЦПГ более длительное время циркулирует как в плазме, так и в мозге крыс по сравнению с ноопептом, на что указывает значительное увеличение его периода полувыведения, а также величины MRT. Более продолжительный период полувыведения ЦПГ, очевидно, связан с его циклической структурой и меньшей протеазной активностью ткани мозга по сравнению с её активностью в плазме крови крыс [4, 5]. Полученные результаты совпадают с литературными данными о большей стабильности циклических структур известных дипептидов по сравнению с их линейными структурами [7]. Структурный фрагмент ноопепта – пролил-глицин образует циклическую форму, которая более длительное время сохраняется в неизмененном виде, что выгодно отличает его от ноопепта.

Кроме того, следует отметить, что ноопепт, являющийся пептидным аналогом пирацетама, значительно превосходит по проницаемости через ГЭБ и тропности к мозговой ткани крыс пирацетам, который проникает через ГЭБ медленнее – максимальная концентрация у крыс после введения внутрь достигается через 2 часа и в этот период устанавливается максимальный коэффициент Кмозг/плазма, который составляет 0,996 [8].

Дилепт

Дилепт является аналогом нейротензина, который не проникает через ГЭБ и проявляет свою активность только при непосредственном введении в мозг. На основе нейротензина и атипичного нейролептика сульпирида создан его аналог, который проявляет фармакологическую активность не только при внутрисосудистом, но, что наиболее важно, при пероральном введении в дозах 0,4–4,0 мг/кг и 4,0–8,0 мг/кг соответственно. Отличительной чертой от известных нейролептиков является его особенность улучшать когнитивные функции и нейропротективное действие [9].

При изучении метаболизма дилепта у крыс было показано, что он подвергается интенсивной пресистемной элиминации с образованием 2 деэстерифицированных продуктов — М1 (N-капроил-L-пролил-L-тирозин) и М2 (N-капроил-Lпролин). При этом показано, что М1обладает собственной фармакологической активностью[10]. На основе структурной формулы молекулы дилепта были рассчитаны основные физико-химические характеристики дилепта и его метаболита, позволяющие прогнозировать хорошую абсорбцию и проницаемость через ГЭБ изучаемых соединений. Молекулярный вес дилепта — 390 а. е. м., значение коэффициента распределения в системе октанол-вода — 2,51, число доноров водородной связи 2, число акцепторов водородной связи — 7. Таким образом, дилепт удовлетворяет описанному ранее методу Lipinski и теоретически может проникать через ГЭБ путём свободной диффузии в физиологических концентрациях. Молекула метаболита дилепта имеет близкие параметры: молекулярный вес — 376 а. е. м., сумма акцепторов водородной связи также, как у дилепта, равна 7, число доноров водородной связи равно 3 и log Р составляет 2,36, но в то же время она более полярная по сравнению с молекулой дилепта, что может влиять на её транспорт через ГЭБ. В связи с быстрой и интенсивной пресистемной элиминацией дилепта у крыс после перорального введения его субстанции, под влиянием энзиматических систем ЖКТ (эстераз и пептидаз) и его предельно низких концентраций в плазме крови у этого вида животных, особенно на терминальном участке фармакокинетической кривой, на основании которого рассчитывается константа элиминации и период полувыведения — параметров, влияющих на величину площади под фармакокинетической кривой, доза препарата была увеличена от 40 мг/кг до 200 мг/кг; при этом, однако, дозовой зависимости «доза-концентрация» неизмененного препарата не наблюдалось, а концентрации образующихся метаболитов (особенно М1) многократно превосходили уровень концентраций неизмененного препарата. Учитывая вышеизложенное, при проведении экспериментов по изучению проникновения дилепта и его активного метаболита М1 через ГЭБ определяли одновременно содержание изучаемых соединений в мозге и плазме крови крыс через 15 мин после введения — времени достижения максимальной концентрации дилепта и метаболита в 2 дозах — 40 и 200 мг/кг. В связи с тем, что не было выявлено дозовой зависимости содержания в плазме и мозге крыс как для дилепта, так и для метаболита, целесообразно привести данные, полученные после введения дилепта в максимальной дозе и через один интервал времени — 15 мин после введения — времени достижения максимальной концентрации изучаемых соединений (табл. 2).

Из представленных в таблице данных видно, что дилепт и его активный метаболит определяются в ткани мозга крыс через 15 мин после перорального введения дилепта, что свидетельствует о проницаемости ГЭБ для этих молекул; при этом коэффициент распределения Кмозг/плазма для дилепта выше и, в среднем, составляет 2,0, а для активного метаболита – 0,5. Отсутствие зависимости «доза-концентрация» можно объяснить разным механизмом транспорта дилепта и его метаболита через ГЭБ. Большое значение коэффициента распределения дилепта между мозгом и плазмой крови крыс указывает на то, что его транспорт может быть реализован по механизму свободной диффузии; проникание же метаболита через ГЭБ, по всей вероятности, осуществляется с участием специфических пептидных переносчиков РеРТ-2, связывание которых с субстратом ограничено [11, 12]. Меньшая величина коэффициента проницаемости ГЭБ для активного метаболита М1, по сравнению с аналогичной величиной этого коэффициента для дилепта, связана с его высокой концентрацией в плазме крови крыс и большей полярностью, вследствие этого ГЭБ осуществляет защитную функцию в отношении мозга, ограничивая поступление в мозг высоких концентраций активного метаболита, что может сопровождаться нежелательными последствиями как со стороны его фармакологического эффекта, так и токсикологического действия. Известно ограничивающее влияние ГЭБ на проникание высоких концентраций гормонов, медиаторов и психоактивных веществ в мозг для предотвращения их нежелательных токсических эффектов.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о различной проницаемости ГЭБ для дилепта и его активного метаболита и предотвращении проникания в мозг высоких концентраций активного метаболита. В то же время полученные данные свидетельствуют о проникании дилепта и метаболита М1 в мозг, с чем может быть связано проявление его центральных эффектов.

Селективный анксиолитик ГБ-115

В соответствии с «правилом пяти» [2], предварительно были рассчитаны физико-химические показатели соединения ГБ-115, являющегося амидом N-фенил-N-гексаноил-Lглицил-L-триптофана, с целью прогнозирования возможности его проникания через ГЭБ. Молекулярная масса соединения ГБ-115 равна 434,52; число доноров водородной связи — 2; акцепторов —3; растворимость в системе октанолвода — 3,15, в соответствии с полученными данными изучаемый дипептид теоретически может проникать через ГЭБ.

Целью данного фрагмента работы было экспериментальное подтверждение проницаемости ГЭБ крыс для анксиолитика ГБ-115.

На основе полученных экспериментальных данных [13] рассчитаны основные фармакокинетические параметры анксиолитика в плазме крови и мозге крыс, которые представлены в табл. 3.

Из представленных в таблице данных видно, что анксиолитик быстро (в течение 0,75 ± 0,25 ч) и интенсивно проникает через ГЭБ в мозг крыс, на что указывает величина его Сmax в ткани мозга, которая на 19 % выше по сравнению с величиной этого параметра в плазме крови, а также значительно больше величина площади под фармакокинетической кривой. По соотношению величин площадей под фармакокинетическими кривыми в мозге и плазме крови крыс было установлено, что соединение ГБ-115 проникает через ГЭБ в мозг с коэффициентом распределения Кмозг/плазма — 1,45, что свидетельствует о высокой тропности анксиолитика к ткани мозга и его возможном непосредственном влиянии на внутриклеточные структуры мозга экспериментальных животных, связанные с проявлением его анксиолитического эффекта. Параметры, характеризующие процесс элиминации дипептида из мозга и плазмы крови крыс имеют близкие значения, за исключением параметра MRT, который в мозге выше, чем в плазме, что может указывать на связывание анксиолитика с клеточными структурами ткани мозга крыс и не исключает возможности его непосредственного влияния на структуры, связанные с реализацией анксиолитического действия изучаемого дипептида.

Заключение

В результате проведённых исследований установлено, что все 3 изучаемые дипептидные соединения с нейротропной активностью, представляющие собой модифицированные аналоги природных нейропептидов — ноотропный препарат ноопепт и его активный метаболит ЦПГ, антипсихотик с позитивным когнитотропным действием дилепт и селективный анксиолитик ГБ-115 обнаруживают высокую тропность к ткани мозга крыс и проникают через ГЭБ с высокими коэффициентами распределения Кмозг/плазма, что может указывать на их непосредственное влияние на центральную нервную систему и формирование фармакологических эффектов этих соединений. В то же время для дилепта и его активного метаболита показаны отличительные особенности проникания через ГЭБ, а именно, отсутствие дозовой зависимости и меньшей величины коэффициента Кмозг/плазма для метаболита по сравнению с неизмененным препаратом, что может указывать на разный механизм транспорта этих соединений через ГЭБ: для дилепта — посредством пассивной диффузии, а для метаболита — с участием системы активных переносчиков, число которых ограничено, и защитную роль ГЭБ от проникания в мозг высоких концентраций активного продукта метаболизма дилепта.

Выводы

1. Установлено, что изучаемые дипептидные аналоги природных нейропептидов проникают через ГЭБ, имеют высокую тропность к ткани мозга крыс, что может свидетельствовать об их непосредственном влиянии на нейромедиаторные системы мозга, принимающие участие в реализации фармакологических эффектов этих препаратов.

2. Показано для дилепта и его активного метаболита отсутствие дозовой зависимости проникания этих соединений в мозг крыс, что, возможно, связано с большой дозой дилепта, высокими концентрациями образующегося активного метаболита, а также различным механизмом транспорта этих соединений через ГЭБ.