Введение

Рост заболеваемости сахарным диабетом (СД) продолжает оставаться одной из основных проблем систем здравоохранения большинства стран мира, включая Российскую Федерацию. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в терапии заболевания, число больных, неудовлетворённых её качеством, остаётся по-прежнему высоким [1]. В этой связи разработка и создание оригинальных подходов к лечению СД является актуальной задачей медицинского сообщества. Учитывая преобладающее значение СД второго типа (СД2) в структуре заболеваемости диабетом (более 80 % случаев), следует отметить, что инсулинорезистентность, характеризующаяся недостаточностью биологического ответа организма на инсулин при его нормальной концентрации в крови, приводит к компенсаторному усилению секреции гормона. Однако в условиях нарастающего энергодефицита возможность нормального функционирования β-клеток ограничена. Их истощение ведёт к неизбежной гибели и развитию абсолютной инсулиновой недостаточности. Перечисленные факты обуславливают перспективность применения цитопротекторных препаратов, способных предотвращать некроз β-клеток и декомпенсацию СД2 [2]. Это, в свою очередь, диктует необходимость разработки информативной методики качественного и количественного анализа числа β-клеток.

Иммуногистохимический анализ (ИГА), основанный на обработке микропрепаратов изучаемых органов меченными антителами к выявляемому веществу (антигену), успешно применяется в лабораторной диагностике последние десятилетия. По сравнению с классическими гистологическими методами, он имеет неоспоримые преимущества, наиболее важными из которых являются высокая специфичность в отношении детектируемого объекта, чувствительность, позволяющая открывать вещество (антиген) при его низкой концентрации в ткани, а также интенсивность полученного сигнала. В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» нами начато внедрение методики ИГА панкреатических β-клеток, позволяющей оценивать влияние потенциальных антидиабетических препаратов на морфологические характеристики островков Лангерганса с использованием высокоспецифичных моноклональных антител к инсулину.

В данной статьей будет приведено подробное описание этого метода, направленного на качественный и количественный анализ β-клеток поджелудочной железы и дифференциальную оценку их выживаемости на модели стрептозотоцин-индуцированного (СТЗ) СД2. В наших предыдущих исследованиях было выявлено наличие цитопротективного действия в отношении β-клеток у ряда нейропротективных веществ [4, 5]. В данной работе для верификации метода ИГА были изучены соли лития, выбор которых обусловлен наличием данных об их нейропротективном эффекте, связанным с ингибированием GSK-3 [3].

Материалы и методы

Дизайн эксперимента. Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Wistar с исходной массой тела 300–320 г. СД2 моделировали путём однократного внутрибрюшинного введения свежеприготовленного раствора СТЗ в дозе 40 мг/кг, растворённого в холодном цитратном буфере (рН = 4,5). В эксперимент включали только животных, у которых через 72 ч после введения СТЗ уровень глюкозы в крови составлял не менее 12– 15 ммоль/л (n = 40). Крыс делили на 4 группы по 10 крыс в каждой. Группе пассивного контроля в первый день эксперимента вводился цитратный буфер, в последующие 28 дней – физиологический раствор. Группе активного контроля вводился СТЗ, в последующие 28 дней – физиологический раствор. Экспериментальным группам с третьего дня после инъекции СТЗ вводился лития хлорид в дозе 10 мг/кг либо лития карбонат в дозе 8,9 мг/кг (эквивалентно 10 мг/кг лития хлорида) в течение 28 дней. По окончании эксперимента животных умерщвляли декапитацией.

Подготовка препаратов. Для иммуногистохимического исследования островкового аппарата поджелудочные железы крыс экспериментальных групп фиксировали в 10 % нейтральном формалине (рН = 7,4) (Sigma, США). Обезвоживание образцов проводили в восходящем ряду спиртов (дважды в 70 %, 95 % и дважды в 100 %) и ксилоле (в течение 1 ч в каждом растворителе), после чего заливали в парафиновые блоки. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм выполняли на микротоме (MicritоmeJungRM2035, Германия). Из каждого блока получали по 15–20 поперечных срезов из различных отделов поджелудочной железы и помещали их на стёкла, обработанные поли-L-лизином (Menzel-Glaser, 76 26 мм). Подготовленные микропрепараты (по 4–5 срезов на стекло) сушили на сухой бане при температуре 40 в течение 60 мин, после чего использовали для исследования.

Перед нанесением антител микропрепараты депарафинировали в двух сменах ксилола и гидратировали в нисходящем ряду спиртов (дважды в 95 % и дважды в 70 %) по 10 мин, после чего промывали в фосфатном буфере PBS (Sigma, США) (10 мин). С целью блокады эндогенных пероксидаз, способствующих неспецифическому окрашиванию ввиду высокой реакционной способности с детектирующим агентом, микропрепараты в течение 10 мин обрабатывали 3 % раствором пероксида водорода.

Иммуногистохимическая реакция. Для предотвращения неспецифического фонового окрашивания за счёт связывания первичных антител с компонентами ткани микропрепараты инкубировали с 10 % раствором нормальной козьей сыворотки (NormalGoatSerum, Abcam, Великобритания) в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее срезы обрабатывали первичными моноклональными антителами к инсулину, полученными от морских свинок (anti-insulinGP 1:500, Abcam, Великобритания). В качестве среды для разведения антител использовали фосфатный буфер. Обработанные микропрепараты оставляли на 24 ч во влажной камере при температуре 2–4 C.

Визуализация результатов иммуногистохимической реакции заключалась в инкубации микропрепаратов со вторичными моноклональными антителами, меченными пероксидазой (anti-insulinGP 1:500, Abcam, Великобритания) в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим использованием набора реагентов (DABVectorPeroxidase, США). Готовые микропрепараты вновь обезвоживали в восходящем ряду спиртов и ксилола и заключали в среду Eukitt (Panreac, Испания). Достоверность результатов исследования достигалась использованием негативных контролей антигенов и антител [6].

Микроскопический анализ. Морфометрическое исследование проводили с использованием микроскопа Aristoplan (Leitz, Германия) с цифровой камерой DCM- 800 (Микромед, Россия), персонального компьютера и программного обеспечения ScopePhoto при увеличении 400, дающего информацию о площади β-клеток и микропрепарата в абсолютных единицах. Рассчитывали долю β-клеток в общей площади среза и количество панкреатических островков. В каждом препарате анализировали все имеющиеся островки Лангерганса.

Исходя из данных литературы о неоднородности реакции β-клеток на повреждающее воздействие СТЗ [7], нами было предложено дифференцировать инсулиноциты по площади, определяя процентное содержание их групп соответствующих размеров (менее 500 мкм2, 501–2500 мкм2, 2501–10000 мкм2, более 10001 мкм2) в общем ряду.

Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Biostat. Проводился расчёт среднего арифметического значения M и стандартной ошибки среднего арифметического SEМ. Характер распределения полученных данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Ввиду наличия нормального распределения данных, статистическую значимость различий между группами оценивали тестом ANOVA. Различие средних показателей считалось достоверным при р < 0,05. Для оценки взаимосвязи непараметрических количественных признаков использовался метод ранговой корреляции Спирмэна.

Результаты и обсуждение

В условиях СТЗ модели СД2 у животных группы активного контроля отмечалось повышение уровня гликемии до 24,1 ммоль/л (при уровне гликемии в группе пассивного контроля 6,1 ммоль/л). Соли лития показали гипогликемическую активность: введение лития хлорида способствовало снижению уровня сахара до 12,4 ммоль/л, лития карбоната до 12,9 ммоль/л. Кроме того, оба соединения восстанавливали положительную динамику массы тела, устраняли симптомы полифагии и полидипсии.

С целью оценки эффекта солей лития на морфологическом уровне через 24 ч после окончания терапии животные забивались декапитацией. Результаты морфометрического анализа поджелудочной железы приведены в табл. 1.

Полученные данные свидетельствуют об уменьшении числа островков, а также абсолютного и относительного количества β-клеток в группе нелеченных диабетических животных по сравнению со здоровыми (рис. 1А, 1В). Островки у диабетических крыс характеризуются снижением количества инсулиноцитов, наличием вакуолизации, склерозирования и дистрофических изменений в структуре ткани. В некоторых островках сохранялись единичные разрозненные инсулин-позитивные клетки. Средняя площадь панкреатических островков у таких животных была почти в 8 раз меньше площади островков здоровых животных. Островки характеризовались неправильной формой. Процентное отношение суммарной площади β-клеток в поперечном срезе железы нелеченных диабетических крыс составляет около 9,5 %, в то время как у здоровых этот показатель достигал 28,1 %. Снижение доли β-клеток у животных активного контроля на 68 % по сравнению с пассивным контролем свидетельствует о наличии развитого СД2 и находится в полном соответствии с полученными ранее данными [8].

Введение диабетическим крысам препаратов лития приводит к заметному восстановлению количества островков и морфологических характеристик β-клеток (рис. 1С, 1D). Отмечено преобладание островков округлой формы. Среднее количество островков в группе лития карбоната составляло 9,66, лития хлорида – 10,52, что в среднем в 1,5 раза превышает данный показатель у нелеченых диабетических животных. Суммарная площадь β-клеток у животных выше таковой у группы активного контроля в 1,5 раза в случае терапии карбонатом лития и в 2 раза – хлоридом лития. Выраженность показателей морфометрии коррелирует с показателями уровня глюкозы в крови: коэффициент корреляции уровня глюкозы с суммарной площадью панкреатических β-клеток составляет 0,653 (рис. 2).

Нами выполнен анализ распределения островков β-клеток по показателю суммарной площади у животных различных групп (рис. 3). Если у здоровых животных преобладают крупные островки, площадью более 10000 мкм2 и практически отсутствуют мелкие, площадью до 500 мкм2, то у крыс группы активного контроля доминируют островки малых размеров. Эти данные полностью соответствуют результатам, ранее полученным в экспериментах на мышах, у которых СД моделировался гиперактивацией GSK-3β [6]. Нами показано, что применение препаратов лития позволяет сохранить выживаемость β-клеток. Это отражает показатель количества крупных островков: у животных пассивного контроля их содержание составляло 38 %, у нелеченных диабетических крыс оно снижалось до 10 %, в то время как терапия солями лития способствовала увеличению их числа до 17–18 %.

Основное преимущество ИГА состоит в том, что он селективно выявляет инсулинопродуцирующие β-клетки, тогда как при использовании других методов, например окраски гематоксилин-эозином, имеет место неспецифическое окрашивание всех типов клеток островков Лангерганса. Если при окраске гематоксилин-эозином по Гомори нами было выявлено 23,0 % выживших клеток, то в случае применения ИГА отмечено снижение доли выживших β-клеток до 9,5 % [4]. Это сопоставление свидетельствует о более точной идентификации и tf

Таким образом, значимость метода ИГА для оценки цитопротективного действия антидиабетических препаратов подтверждена данными изучения солей лития, выбор которых обусловлен представлениями о роли гиперактивности GSK-3 в развитии СД и их способности ингибировать этот энзим [3]. Активность солей лития проявлялась в восстановлении абсолютного и относительного количества инсулинопродуцирующих клеток, увеличении доли островков средних и крупных размеров и нормализации морфологических характеристик инсулиноцитов.