Введение

Нейродегенерация в головном мозге — ключевое звено патогенеза ряда широко распространённых заболеваний, таких как нарушения мозгового кровообращения, болезни Альцгеймера и Паркинсона, депрессия и др. Инвалидизация вследствие нейродегенеративных процессов представляет собой серьёзную социальноэкономическую проблему, поэтому поиск высокоэффективных нейропротекторов является актуальной задачей фармакологии.

Высоким терапевтическим потенциалом обладают эндогенные нейропротекторные белки — нейротрофины, такие как мозговой нейротрофический фактор (brainderivedneurotrophicfactor, BDNF) и фактор роста нервов (nervegrowthfactor, NGF) [1]. Однако клиническое применение нейротрофинов ограничено нестабильностью в биологических жидкостях, плохой способностью проникать через гематоэнцефалический барьер и побочными эффектами, обусловленными плейотропностью [2, 3].

В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова на основе бета-изгибов 4 петель NGF и BDNF сконструированы и синтезированы димерные дипептиды, соответственно гексаметилендиамид бис(N-моносукцинилL-глутамил-L-лизина (ГК-2) и гексаметилендиамид бис(N-моносукцинил-L-серил-L-лизина) (ГСБ-106) [Патент РФ №2410392, 2010; Патент США № 9683014 B2, 2017; Патент Китая №102365294 B, 2016]. Показано, что ГК-2 и ГСБ-106 активируют специфические для полноразмерного белка тирозинкиназные рецепторы, соответственно TrkA и TrkB, и обладают нейропротекторной активностью invitro в микро-наномолярных концентрациях на различных клеточных моделях, в том числе на модели окислительного стресса [46]. Нейропротекторная активность ГК-2 и ГСБ-106 была подтверждена invivo на модели обширного ишемического инсульта, вызванного транзиторной окклюзией средней мозговой артерии у крыс [7–9]. Для ГК-2 было показано, что он лишен основных побочных эффектов, характерных для NGF, а именно он не вызывает гиперальгезии и потери веса [6].

Для получения дополнительных данных о цитопротекторных свойствах дипептидов ГК-2 и ГСБ-106 представляло интерес изучить их на модели окислительного стресса у инфузорий [10, 11]. Известно, что окислительный стресс является одним из основных механизмов повреждения нейронов при различных патологиях. Для моделирования окислительного стресса как invitro, так и invivo широко используются соли тяжёлых металлов [11–13] – экзотоксикантов, потенциально опасных для всех живых организмов. Ионы свинца, кадмия, цинка и других тяжёлых металлов способны инициировать генерацию избыточного количества активных форм кислорода [13–15], повышенный уровень которых в клетке способствует запуску цепных реакций окислительной деградации биомолекул.

Одноклеточные, в частности инфузории, представляют собой удобный модельный организм для фармакологических исследований, поскольку в данном случае преимущества, свойственные использованию культуры клеток, дополняются тем, что в данном случае тестсистемой является одновременно и отдельная клетка, и целостный организм. Следует отметить, что для инфузорий, как и для других одноклеточных организмов, нет данных в литературе о наличии тирозинкиназных рецепторов, подобных рецепторам нейротрофинов у позвоночных, которые могли бы опосредовать фармакологические эффекты дипептидов ГК-2 и ГСБ-106. Тем не менее, у инфузорий были обнаружены ростовые факторы, регулирующие выживаемость и пролиферацию, подобные нейротрофинам [16, 17], что предполагает наличие подобных рецепторных систем.

Целью данного исследования стало изучение эффективности дипептидных миметиков нейротрофинов ГК-2 и ГСБ-106 в модели окислительного стресса у инфузорий, вызванного солями тяжёлых металлов.

Материалы и методы

Работа выполнена на культуре Раrameciumcaudatum – одном из наиболее часто используемых тест-объектов для лабораторных исследований, направленных на определение прямого действия химических соединений. Культуру клеток парамеций выращивали на среде Лозина–Лозинского с добавлением питательной среды, содержащей дрожжи Saccharomycescerevisiae. Клетки, взятые в log-фазе роста, инкубировались при температуре 24 ± 2 С, рН = 6,8–7,0.

Окислительный стресс моделировали [10] добавлением к 1 мл среды с инфузориями Parameciumcaudatum 1 мл водного раствора одной из солей металлов (хлорид кадмия, ацетат свинца, сульфат меди, сульфат цинка) в конечных концентрациях 1; 5; 10 и 15 мкМ. Длительность инкубирования клеток в среде, содержащей соль тяжёлого металла, составляла 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 час, 2 часа, 6 часов. За 45 мин до внесения инициатора окислительного стресса в среду с опытными клетками добавлялся 1 мл раствора ГК-2 или ГСБ-106 в концентрациях от 10–5 до 10–8 М. Активные концентрации ГК-2 и ГСБ-106 были выбраны на основании предыдущих экспериментов [4, 5, 18].

На всех этапах эксперимента с помощью pH-метр контроллера KelilongPH-221 измеряли рН среды. Регистрировали численность клеток, интенсивность их деления; характер и скорость движения инфузории, изменение формы клетки. Численность клеток определяли под микроскопом при увеличении 7-10 с видеорегистрацией путём подсчёта их общего количества в 1 мл культуры.

Полученные результаты представлены как среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего. После проверки распределения на нормальность значимость различий между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Под влиянием действия ионов тяжёлых металлов численность клеток заметно снизилась, особенно выраженные последствия отмечались при концентрациях 10–15 мкМ солей тяжёлых металлов (рис. 1). При этом в клетке происходил ряд морфологических изменений, в том числе реорганизация структур цитоскелета, приводящих к клеточной гибели. Наблюдалось набухание органелл цитоплазмы, которое приводило к разрыву мембраны клетки парамеций. Снижение численности опытных клеток в результате деструктивной мембранной патологии свидетельствовало об интенсификации процессов свободно-радикального окисления, вызванной ионами тяжёлых металлов. После 6 ч инкубации с растворами солей тяжёлых металлов (10 мкМ) количество выживших клеток в культуре Раrameciumcaudatum составило примерно от 15 до 25 % от пассивного контроля (без повреждения) (максимальное количество — в среде с сульфатом меди).

Дипептиды ГК-2 и ГСБ-106 во всех изученных концентрациях защищали клетки от гибели, вызванной действием тяжёлых металлов. Максимальный нейропротекторный эффект дипептиды проявляли в концентрации 10–8 М (рис. 2). В этой концентрации исследуемые соединения практически полностью предотвращали гибель инфузорий даже через 6 ч инкубирования с солями тяжёлых металлов (10 мкМ) (см. рис. 2).

Эффективность ГК-2 и ГСБ-106 в данной модели предполагает, что у Parameciumcaudatum присутствуют рецепторные системы, подобные тирозинкиназным рецепторам нейротрофинов у позвоночных, что соответствует литературным данным о наличии у инфузорий ростовых факторов, регулирующих выживаемость и пролиферацию [16, 17].

Заключение

Таким образом, нами установлено, что дипептидные миметики NGF и BDNF, соответственно ГК-2 и ГСБ106, в концентрации 10–8 М полностью защищают от гибели клетки Paramecium caudatum в условиях окислительного стресса, вызванного солями тяжёлых металлов (хлоридом кадмия, ацетатом свинца, сульфатом меди, сульфатом цинка).