Введение

В 1996 г. в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова был открыт эндогенный пептид циклопролилглицин (ЦПГ) [1], для которого были выявлены ноотропные [2], анксиолитические [3], антигипоксические [4] и нейропротекторные свойства [5]. Было показано, что ЦПГ по структуре и фармакологической активности подобен пирацетаму [2–5]. Кроме того, было выявлено, что ЦПГ аналогично пирацетаму оказывает положительное модулирующее действие на глутаматные AMPA-рецепторы [6] и усиливает синтез нейротрофина BDNF [7].

Нами был сконструирован линейный глипролин ГЗК-111, этиловый эфир N-фенилацетил-глицил-L-пролина, химическая структура которого предполагает возможность превращения его в ЦПГ в биологических средах. Действительно, ГЗК-111 in vitro в плазме крови крысы превращается в ЦПГ и проявляет весь спектр фармакологической активности, характерный для последнего [8, 9].

Для расширения группы фармакологически активных замещенных глипролинов в настоящей работе был синтезирован ряд аналогов ГЗК-111 с разным замещением по C- и N-концу и изучена их нейропротекторная активность in vitro.

Цель исследования

Цель данной работы состояла в изучении нейропротекторной активности аналогов замещённого глипролина ГЗК-111 по C- и N-концу in vitro на модели оксидативного стресса в сравнении с ЦПГ.

Материалы и методы

Экспериментальная химическая часть

В работе использовали коммерческие аминокислоты (Sigma, Reanal). Используемые растворители очищали и сушили стандартными методами. Температуру плавления определяли в открытых капиллярах на приборе Optimelt MPA100 (Stanford Research Systems, США) и не корректировали. ПМР-спектры регистрировали в растворах диметилсульфоксида(ДМСО-) или CDCl в шкале δ, м. д. (J, Гц) на спектрометре Fourier 300 (Bruker, Германия) с рабочей частотой 300 МГц. В качестве внутреннего стандарта использовали тетраметилсилан. Удельное оптическое вращение измеряли на поляриметре ADP 440 Polarimeter (Bellingham + Stanley Ltd., Англия).

ТСХ проводили на пластинках Kieselgel 60 G/F254 (Merck, Германия) в системах диоксан – вода 9:1 (А), хлороформ – метанол 9:1 (Б) и бензол – уксусная кислота – вода 3:1:1 (В). Соединения с амидными группами обнаруживали в парах йода, соединения   с открытой карбоксильной группой – бромкрезоловым зелёным, содержащие ароматические группы – в УФ-лучах. Элементный анализ проводили на приборе для определения углерода и водорода с четырьмя электрическими печами (600-900 °С, тип МА-Г/6Р, завод ЛЭТО, Россия) в токе кислорода и на аппарате для определения азота с тремя такими же электрическими печами в токе углекислого газа. Данные элементного анализа соединений относительно процентного содержания С, Н и N отклоняются от теоретических не более чем на 0,4 %.

Энантиомеры   этилового          эфира   N-фенилацетил-глицилпролина (С H -CH -C(O)-Gly-ProOC H ). Получали аналогично [8].

C H -CH -C(O)-Gly-L-Pro-OC H (ГЗК-111): т.пл. 111-112 °С; [α]23 -90,0 ° (с 1, вода); R = 0,80 (А).

CH -CH -C(O)-Gly-D-Pro-OCH(ГЗК-121): т.пл. 112-113 °С; [a]23 +90,0 ° (с 1, вода); R = 0,80 (А). N-фенилацетил-глицил-L-пролин (C6H5-CH2C(O)-Gly-L-Pro-OH, ГЗК-115). Получали аналогично [9]. Т.пл. 165-166 °С; [α]23 -75 ° (с 1, метанол); R = 0,35 (А).

Метиламид       N-фенилацетил-глицил-L-пролина (C H -CH -C(O)-Gly-L-Pro-NHCH , ГЗК-119). Получали аналогично [9]. Т.пл. 180-181 °С; [α]23 -76 ° (с 1, метанол); R = 0,31 (Б).

Этиловый эфир N-фенилпропионил-глицил-L-пролина   (C6H5-(CH2)2-C(O)-Gly-L-Pro-OC2H5, ГЗК-45).

К охлажденному до -10 °С раствору 3 г (14,5 ммоль)мN-фенилпропионил-глицина в 10 мл диметилформамида (ДМФА) при интенсивном перемешивании одновременно прибавляли 1,89 мл (14,5 ммоль) изобутилхлорформиата и 2,32 мл (18,125 ммоль) N-этилморфолина. После 2-3 мин перемешивания прикапывали раствор 3,25 г (18,125 ммоль) хлоргидрата этилового эфира пролина и 1,86 мл (14,5 ммоль) N-этилморфолина в 15 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали ещё 30 мин прим-10 °С и 1 ч при комнатной температуре. Осадок отфильтровывали, фильтрат упаривали в вакууме, остаток растворяли в CHCl3. Раствор последовательно промывали 3 % NaHCO3, водой, 1М раствором HCl и вновь водой, высушивали безводным сульфатом натрия и упаривали. Полученное масло перекристаллизовывали из смеси этилацетата и гексана и получали 3 г (62 %) этилового эфира N-фенилпропионил-глицил-L-пролина в виде кристаллического продукта. Т.пл. 111-112 °С; [α]23 -83° (с 1, этанол); R = 0,8 (В). ПМР-спектр (ДМСО-d ) δ, м.д.: 1,21 (м, 3Н, СН СН О), 1,73-2,27 (м, 5Н, СγН Pro, СβН Pro, Ph-CH -CH ), 2,46 (м, 1Н, СβН Pro), 2,83 (м, 2Н, J1 = 7,82, Ph-CH -CH ), 3,38-3,62 (м, 2Н, СδН Pro), 3,78-4,2 (м, 4Н, СН СН О, СαН Gly), 4,3 (д.д., 1Н, СαН Pro, мажорный конформер), 4,68 (д.д., 1Н, СαН Pro, минорный конформер), 8,06 (т, 1Н, J = 5,12, NH Gly). Элементный анализ: вычислено, %: C 63,39; H 7,37; N 8,20; найдено, %: С 63,18; H 7,33; N 8,75; C H N O * 0,5H O.

Амид N фенилпропионилглицилL – пролина (CH -(CH ) -C(O)-Gly-L-Pro-NH , ГЗК-50). Раствор 0,300 г (0,9036 ммоль) этилового эфира N-фенилпропионил-глицил-L-пролина в 5,625 мл насыщенного аммиаком метанола оставляли плотно закрытым на 14 дней при комнатной температуре. Окончание реакции определяли с помощью ТСХ. После завершения реакции метанольный раствор упарили досуха, полученное масло перекристаллизовывали из этилового спирта. Получали 0,170 г (85 %) амида N-фенилпропионил-глицил-L-пролина в виде кристаллического продукта. Т.пл. 188-190 °С. [α]23 -62,2 ° (с 1, метанол). R = 0,41 (Б). ПМР-спектр (CDCl ) δ, м.д.: 1,93-2,4 (м, 4Н, СβН Pro, СγН Pro), 2,57 (м, 2Н, Ph-CH2-CH2), 2,99 (м, 2Н, Ph-CH2-CH2), 3,42-3,59 (м, 2Н, СδН Pro), 4,05 (д, J = 4,32, 2Н, СαН Gly), 4,3 (д.д., 1Н, СαН Pro, мажорный конформер), 4,57 (д.д., 1Н, СαН Pro, минорный конформер), 5,45 и 6,68 (два с, 2Н, NH2), 6,45 (с, 1Н, NH Gly), 7,2-7,3 (м, 5Н, Ar).

Экспериментальная биологическая часть

Для       экспериментов               использовались             реактивы: Н О (Panreac), MTT (Sigma Aldrich), ДМСО Panreac), среда ДМЕМ (HyClone), фетальная бычья сыворотка FBS (Gibco).

Эксперименты проводились на клетках гиппокампа мыши линии НТ-22 (Голландия, Утрехт). Клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением 5 % FBS в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % CO2.

Оксидативный стресс моделировали путём внесения перекиси водорода в конечной концентрации 1,5 мM) [10]. Спустя 30 мин среду заменяли на обычную. Через 4 ч выполняли измерение жизнеспособности клеток.

Жизнеспособность клеток измеряли с использованием MTT-теста с добавлением 0,5 % раствора бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолия (MTT), для растворения образующихся кристаллов формазана использовали ДМСО. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Multiscan EX при длине волны 600 нм [11].

Исследуемые соединения (ЦПГ, ГЗК-115, ГЗК119, ГЗК-121, ГЗК-45 и ГЗК-50) растворяли в деионизованной воде и вносили за 24 ч до повреждения или сразу после смены среды в конечных концентрациях 10-5 – 10-8М.

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом по Данну (ANOVA). Данные представлены в виде m. ± s.d. Данные считались достоверными при p  0,05.

Результаты и обсуждение

Синтез замещённых глипролинов был осуществлён по общей схеме:

Низкоалкильные эфиры N-фенилалканоил-глицилпролинов (ГЗК-111, ГЗК-121, ГЗК-45) получали (схема 1) методом смешанных ангидридов с использованием изобутилхлорформиата в условиях Андерсона [12]. В качестве карбоксильной компоненты использовали N-фенилалканоилглицин, полученный из глицина и хлорангидрида соответствующей фенилалкановой кислоты по Шоттен-Бауману [13], этиловый эфир пролина, полученные из метанола или абсолютного этанола в присутствии хлористого тионила по методу Бреннера [14]. Амиды N-фенилалканоил-глицил-пролинов (ГЗК-113 и ГЗК-50) получали обработкой этилового эфира соответствующего N-замещённого дипептида аммиаком в метаноле. Дипептид ГЗК-115 с открытой карбоксильной группой получали гидролизом 1 М щёлочью этилового эфира N-фенилацетил-глицил-L-пролина. Метиламид N-фенилацетил-глицил-L-пролина (ГЗК-119) получали аминолизом метиламином соответствующего метилового эфира.

Оксидативный стресс, вызванный Н О (1,5 мM), приводил к достоверному снижению жизнеспособности гиппокампальных клеток линии НТ-22. L-ЦПГ защищал клетки от повреждения Н2О2 в концентрациях до 10-7М в обеих схемах внесения соединения. ГЗК-115 защищал клетки НТ-22 от гибели, подобно L-ЦПГ, в обеих схемах эксперимента в концентрациях до 10-7М. ГЗК-119, внесённый за 24 ч до повреждения клеток, обладал цитопротекторным эффектом в концентрации 10-7М, а после повреждения перекисью – в концентрациях 10-6 – 10-7М. ГЗК-121 и ГЗК-45 были эффективны в концентрациях до 10-6М в обеих схемах эксперимента. ГЗК-50 защищал клетки от гибели только в схеме внесения соединения после Н2О2 (табл.1).

Таким образом, все полученные замещённые глипролины обладали нейропротекторной активностью в экспериментах in vitro в условиях окислительного стресса на клетках HT-22, причём наиболее выраженная наблюдалась для соединений ГЗК-119 и ГЗК-115. Можно предположить, что выявленные нами различия в защитном действии исследуемых замещённых глипролинов на модели оксидативного стресса могут быть обусловлены особенностью строения их молекул.